第十五章-精斑检验课件

1、第十五章 精液斑检验NSMC XDD1 精液（斑）检验是法医学鉴定实践中的一项重要内容，与血痕检验占有同等重要地位，特别是对有关性犯罪或有性犯罪嫌疑的案件，以及对死亡性质不明的女尸检查，精液（斑）的检验尤为重要。 精液（斑）的法医学鉴定，可为判断案件性质、划定侦查范围、认定或排除犯罪嫌疑人提供重要线索。在亲子鉴定或其它有关性功能鉴定中，有时需对新鲜精液进行检验。2精液: 男性各附属性腺分泌物所形成的复杂混合物，精囊液约占5080，前列腺液占1530，尿道球腺液，尿道旁腺液约占5。精液斑： 精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。第一节 概述34男性附属性腺分泌物的混合液，输送精子，为精子提供

2、营养，激发精子活力等。 精子 精液 精浆 男性生殖细胞，含亲代遗传物质，由睾丸产生，每次射精大概有0.6-2亿个精子。5精液理化分析细胞成分：精子、睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等非细胞成分（90%是水）： 无机物：水、盐类、金属离子（锌） 有机物 糖类（果糖）、脂类、黄素、精胺、卵磷脂共有蛋白:白蛋白、酸性磷酸酶(ACP)等特有蛋白:PSA、DIA3等精液功能蛋白：凝固酶、中性蛋白酶和纤溶酶等6精子的形态特点 正常精子分头、体、尾三部分，长约60m，外形似蝌蚪,头部长35m，宽23m,厚l2m,正面观呈卵圆形，侧面观呈梨形，主要由顶体和致密的精子细胞核组成。细胞核，致密，重要成分是DNA

3、空泡状，含多种水解酶和糖蛋白线粒体鞘7精子产生过程凝固酶（精囊腺）5min内凝固成较冻状 中性蛋白酶及纤溶酶（前列腺）20-30min内液化成稀薄半流动体8精斑检验的目的：为案件侦查和审理提供线索和证据。需解决的问题：斑痕是否为精斑？若是精斑，确定精斑的个体来源。精斑检验程序：肉眼检验预试验确证试验个人识别9第二节 精液斑的肉眼检查精斑的形态： 无固定形态，外观常因附着物不同而有差异，在软质载体，如衣裤、纸张、床单上等，手触之有硬感，新鲜精斑有特殊腥气味。 典型的精斑呈不规则地图状，在深色纺织品上呈灰白色浆糊状斑迹；在浅色纺织品上，多呈黄白色地图状，边缘色深。10床单上精液斑11精斑的分布：

4、多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣裤、女性外阴部、大腿内侧、腹壁，偶见口腔内、肛门。现场的被褥、草席、床板、毛巾、纸张、沙土、丢弃的避孕套等。此外，阴道擦拭物也是常见的精斑检材。12尸体上的精斑13强奸杀人现场遗留纸团14紫外辅助检查：原理：精斑中的黄素在紫外线下呈银白色荧光，斑痕边缘呈浅紫蓝色特点：对检材无污损、无破坏，不影响进一步检验特异性差（干扰物：阴道液、尿液、唾液、某些色素染料）作用：仅能为进一步检验提供可疑部位结果分析：阳性仅表明可能是精斑，阴性不能轻易否定精斑151617床上的精斑在紫外灯下18 肉眼检验的意义：发现可疑精斑，确定部位和分布情况，以便准确取材。19第三节 精液斑的预试

5、验性质：筛选试验 磷酸苯二钠试验 酸性磷酸酶试验 -磷酸萘酚-固蓝B试验方法： 其它：碘化碘钾结晶试验、苦味酸结晶试 验、锌检出法等特点：方法简便易行，灵敏度高，但特异性差20实验依据：精斑中的酸性磷酸酶含量高：约是其他脏器的100倍；也远远高于动物精液及其他动、植物组织中的含量，但猴与人相似。来源于前列腺精斑中酸性磷酸酶稳定性好： 抗腐败-常温保存10年、夏季室温8周腐败； 耐高热-125加热30min仍可检出活性。 一、酸性磷酸酶检验(acid phosphatase, ACP)21磷酸苯二钠试验(Kind-King法)原理： 精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生萘酚，后者经铁氰化钾作

6、用并与氨基安替比林结合，生成红色醌类化合物。2223方法： 取可疑斑痕0.10.1cm（最好取斑痕边缘部位）置试管内，加缓冲液3-4滴，37温箱内5-10分钟后，加等量显色液。结果判定： 阳性：立即出现红色，表明检材可能是精斑。 阴性：呈橙黄色，表明检材不是精斑或ACP被破坏。24由左至右：强阳性、阳性、弱阳性、阴性25注意事项：应同时剪取无斑痕处检材及已知精斑作阴性和阳性对照。被水洗过淡质精斑，应适当延长缓冲液浸泡时间。怀疑为假阳性，可适当加温或延长放置时间。试验灵敏度高（剪取检材顺序：先空白、次可疑精斑、最后已知精斑）特异性较差。26-磷酸萘酚-固蓝B试验原理：-磷酸萘酚 -萘酚 偶氮化合

7、物（紫红色）特点：灵敏度好，特异性差阴道液等可能呈阳性反应。ACP固蓝B27 人精液中含有一些成分，与不同试剂结合，能形成一定形态的结晶体，据此可推测精斑的存在。 但形成结晶体非精液斑所特有，人体其它器官（肝肾）等浸出液以及其它分泌液（阴道液、尿液）等也可形成类似结晶。同时，精液斑受到尿液、血液等污染时，则不出现阳性反应。结晶试验灵敏度低、特异性差，仅作为指向实验。 二、结晶试验28过碘胆碱2930苦味酸结晶试验原理：精素分解产物与苦味酸生成精素苦味酸结晶（青黄色有折光的十字、柱、星形结晶） 特点：动物精液一般不出现阳性。3132三、锌检出法 原理： 人体组织和体液中精液含锌量最高，精液中的锌

8、主要来自前列腺，此法适用于无精子精斑。 特点： 特异性很高，除乳汁（稀释后阴性），其它分泌物、体液、排泄物均呈阴性。混入血迹不影响结果。33 预试验注意：除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，预试验阴性的检材有时仍需进行确证试验。精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验。34第四节 精斑的确证试验 精斑的确证试验是检验精斑中的特有成份，其阳性结果可以确证精斑。主要有三类方法：精子检出、免疫学检验和生物化学检验。35一、精子检出法显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，可被法医实验室广泛采用。精子具有典型而稳定的

9、形态，不易受其他因素影响而改变。在精斑中的精子形态相当稳定，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。镜下观察精子是无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。36正常未经染色精子形态373839上清：抗人精沉淀试验；中和试验精斑检材的处理：沉渣：涂片，染色，检验精子40藻红染色法： 精子头部和尾部均染成红色。亚甲蓝染色法： 精子头后部染成深蓝色，头前部、尾部不着色或浅染。41亚甲蓝染色精子42HE染色法： 苏木素染液 0.5伊红染液 1盐酸酒精溶液镜检：精子头前半部不着色或浅染，后半部呈蓝色，尾部红色43酸性品红亚甲基蓝染色法镜检：精子头部呈红色，尾部呈蓝色44性交后精子存活时间：阴道 3-8h宫颈

10、2-5天子宫、输卵管 1-10天在性犯罪案件中，取阴道试子的时间越早越好，提取部位为阴道后穹窿。45精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，只要找到一个完整的典型精子，即能确证人精斑。精子尾部断落，常只检见精子头部，应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头部呈椭圆形，着色特殊。若发现几个典型的精子头部也可确证为精斑。464748二、免疫学试验优点:灵敏度高适用于输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑方法：抗人精血清沉淀反应 胶体金法 前列腺特异性抗原的检测 ELISA法49抗人精血清沉淀反应原理： 用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应，出现肉眼所见白色沉淀为阳性反应，证明检材含有人精

11、液方法：环状沉淀反应，琼脂双向扩散试验，对流免疫电泳注意：用已知人精斑作阳性对照，检材无精斑部位作阴性对照5051前列腺特异性抗原p30的检测 前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA）又称-精浆蛋白，由人类前列腺上皮细胞所分泌，是成年男子精浆中特有的一类糖蛋白，分子量30 000，故名p30，性质稳定，是确证精液斑的理想标记。常用检测方法有免疫胶体金法和ELISA。 抗-p30血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异性，灵敏度和准确性均高于精子检出法，不受精液中无精子的影响。52（一）胶体金法 原理及方法与胶体金法确证血痕一样，不同的是精斑确证试验胶体金

12、标记的是鼠抗人p30单克隆抗体，检测线包被另一种鼠抗人p30单克隆抗体；质控线包被羊抗鼠IgG抗体。53（二）ELISA法54三、其它确证精斑方法乳酸脱氢酶-X：仅出现于人精子微量元素检测法抗人精子单克隆抗体免疫组化法55第五节精斑的个人识别血型：ABO系统等血清型：维生素结合蛋白（DPB）、Km、Gm等酶型：PGM1, 岩藻糖苷酶、黄递酶等DNA分析：VNTR, STR, Y-STR等选择原则： 良好的遗传多态性；较稳定；检测方法标准化、简单、结果重复性好。测定精液斑中的遗传标记：56（一）精斑的ABO血型测定 分泌型：分泌液与体液中检出ABH抗原 人体液、分泌液中的ABH血型物质是糖蛋白，

13、以水溶性形式存在，而分泌型精液中的ABH血型物质的含量比红细胞中多且耐热，非分泌型精液中ABH血型物质含量少，常规方法不易检出。571.吸收试验2.解离试验3.中和试验 精斑中的水溶性ABH物质能与相应抗体特异性结合，使抗体与指示红细胞的凝集反应能力降低或完全消失，红细胞不凝为阳性反应，证明精斑中含有与抗体相对应的抗原。58方法：精斑浸出液凹玻板倍比稀释至1：2048，加入效价为4的抗血清（A、B、H）各1滴室温30min 加2的指示红细胞，摇匀静置30min 观察结果结果判定：精液检材与基质的抑制凝集相差3级以上阳性5960特点：准确性较吸收法高可与精斑确证试验同时进行能判断分泌能力强弱，并

14、能区分是否是分泌型检材浸出液混浊时，可水浴煮沸10min，离心，以除去蛋白、细菌、酶类等干扰注意：抗血清效价一定要标化，一般以4为好。614.酶标抗体免疫测定法 精斑的ABO血型测定常用直接斑点ELISA法、间接斑点ELISA法及斑点ELISA双抗夹心法，尤以直接斑点ELISA法操作简单，常作为首选方法。625.DNA分型PCR-直接测序法PCR-RFLP法63（二）精斑的血清型测定精液中的多态性蛋白：Gm、Km、GC、血清类粘蛋白（三）精斑的酶型测定PGMl型测定岩藻糖苷酶型黄递酶型-GGT型测定64PGM1型测定磷酸葡萄糖变位酶：普通凝胶电泳可检出7条谱带。65DIA型 黄递酶型（diaphorase, DIA），DIA3仅存在于人类精子和睾丸中，是男性生殖细胞特有的一种遗传标记，且分型不受阴道液和其它体液的影响。66（四）精斑的DNA分析精液中的DNA：精子、睾丸细胞、上皮细胞精液DNA数据：每个精子含DNA约2.5 pgPCR分析所需精液量低于5 ul，仅需10个精子正常成人每次射精约35 ml，约0.62亿个精子67精子细胞核特点： 大量二硫键，能抵抗去污剂和外源性蛋白酶提取DNA需加入还原剂（如DTT） 二步消化法提取精阴混合斑精子DNA。DNA提取方法：有机溶剂法：纯度高，损耗大Chlelex-100法：纯度低，仅适用于PCR其它6