猪源双歧杆菌发酵工艺的研究.

1、 毕业设计论文猪源双歧杆菌发酵工艺的研究学 院：化工与材料学院专 业： 姓 名： 指导老师： 生物工程任妍菲 学 号： 职 称： 0605411005周新明高级工程师中国珠海二一年 五月北京理工大学珠海学院毕业论文诚信承诺书本人郑重承诺：我所呈交的毕业论文?猪源双歧杆菌发酵工艺的研究?是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，论文使用的数据真实可靠。承诺人签名： 日期： 年 月 日猪源双歧杆菌发酵工艺的研究摘 要双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，是人体有益菌中最值得重视和研究的一种，它与人体的健康密不可分，可以说是大自然赐予人类的

2、健康法宝。双歧杆菌的研究和生产具有很好的开展前景。双歧杆菌一般能从动物身上提取，猪的胃上皮细胞黏膜附有有大量双歧杆菌。从猪的粪便中别离出双歧杆菌，并将其扩大生产。适宜的生长条件对双歧杆菌的生长速度、菌体形态、活菌数、代谢产物有良性的影响。因此通过研究，获得双歧杆菌生产的最优工艺方案有非常重要的意义。关键词：双歧杆菌 发酵工艺THE STUDIES OF PIGGED-SOURSE BIFODOBACTERIUM FERMENTATION PROCESSABSTRACTBifodobacterium is a sort of physiological bacteria inside human

3、 body, and is also one of the probiotics which deserves to be valued and researched on. It is inseparably connected with human health and could be described as a treasure of heath given to humanity by the nature. Therefore, the research and production of bifodobacterium could prove to be promising.B

4、ifodobacterium is partly extracted from an animal, like a pig, who has a huge amount of epith cells of gastric mucosa. Thus bifodobacterium could be isolated from the excrement of pigs and the cultures could be expanded. A proper condition of culture has a positive effect on the growth speed, morpho

5、logical characteristics, number of vial bacteria and metabolites of bifodobacterium. Therefore this research is crucially important to acquire an optimal technology scheme of the culture of bifodobacterium.Key Words: bifodobacterium fermentation process目 录 TOC o 1-3 u 摘 要 PAGEREF _Toc229819070 h IAB

6、STRACT PAGEREF _Toc229819071 h II1引言11.1 研究背景11.1.1 研究单位简介11.2 双歧杆菌的作用21.2.1 改善人体肠道功能21.2.2 恢复人体菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康21.2.3 控制人体内毒素的水平，保护肝脏病增强肝脏的解毒、排毒功能21.2.4 降血脂作用，防止动脉硬化个高血压21.2.5 免疫调节作用31.2.6 营养作用31.2.7 提高SOD酶活力，消除人体自由基31.2.8 抗肿瘤、预防癌症41.3 研究意义41.3.1双歧杆菌开发现状41.3.1.1 双歧杆菌因子的开发与应用 41.3.1.2 双歧杆菌营养液 41

7、.3.1.3 新型酸奶的开发与应用 51.3.1.4 双歧杆菌药品的开发51.3.2 双歧杆菌生物工程展望52 材料72.1样品来源72.2主要实验试剂72.3主要仪器与设备73 双歧杆菌的别离和鉴定83.1实验方法83.1.1 别离纯化方法83.1.2 厌氧培养83.1.3 仔猪肠道双歧杆菌的初步鉴定83.2 本章小结94仔猪肠道双歧杆菌的生长特性研究104.1 操作方法104.1.1 试验方法104.1.2 检测方法104.2 培养温度104.3 起始pH114.4 培养基的选定124.4.1 碳源124.4.2 氮源124.4.3 生长因子124.5测定双歧杆菌的生长曲线134.6 本章

8、小结155 双歧杆菌发酵工艺条件的优化研究165.1 双歧杆菌制剂的生产工艺流程165.2 发酵方案确实定165.3 厌氧发酵培养基组成及发酵条件确实定165.3.1 厌氧发酵的培养基组成165.3.2 发酵控制条件165.4 发酵液活菌数的检测165.5 10L发酵罐扩大培养试验175.6 100L发酵罐扩大培养试验185.7 本章小结186 结论与展望196.1 结论196.2 展望19参考文献20附录I 培养基的配置21附录II 双歧杆菌的糖代谢途径22页码用罗马数字，宋体五号，居中谢辞 PAGEREF _Toc229819090 h 241 引言1.1 研究背景双歧杆菌属Bifodob

9、acterium Orla-Jensen,1924归属于放线菌门Actinobacteria放线菌纲Actinobacteria科里氏杆菌亚纲Coriobacteridae双歧杆菌目Bifidobacteriales双歧杆菌科Bifidobacteriaceae。双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌，是人体有益菌中最值得重视和研究的一种，它与人体的健康密不可分，可以说是大自然赐予人类的健康法宝。Tissier于1899年和1900年首先描述了别离自哺乳婴儿粪便的一种革兰氏阳性、弯曲和常见分叉的杆菌，命名为两歧双歧杆菌。双歧杆菌的细胞形态呈现多种多样：有短杆较规那么或纤细状带有尖细末端的细胞，有

10、呈球形的，也有长而稍弯曲的或呈各种分支或分叉形、棍棒状或勺形。单个或链状，V形、栅栏形排列或聚集成星状。革兰氏染色阳性，不抗酸，专性厌氧，无芽孢、荚膜或鞭毛，不运动，触媒隐形，硝酸盐复原阴性，靛基质阴性，明胶液化阴性，精氨酸水解阴性。最适生长温度3741，初始生长最适pH6.57.0。发酵葡萄糖产生乳酸和醋酸。到目前为止，已报道的双歧杆菌有28个种。主要有青春双歧杆菌B.adolescentis、长双歧杆菌B.longum、两歧双歧杆菌B.bifidus、精华双歧杆菌B.essensis、短双歧杆菌B.breve、乳酸双歧杆菌B.lactis、婴儿双歧杆菌B.infantis、侧芽双歧杆菌B.

11、laterosporus等。它们主要栖居于人体和动物的肠道，反刍动物的瘤胃。小肠上部几乎检测不出，小肠下部数量可达103109cfu/g，大肠粪便中可达1081012cfu/g。此外，在人的牙齿缝穴和阴道以及污水中也有双歧杆菌栖居。许多动物如鸡、猪、犬、小鼠、地鼠、狼、猴、家兔、牛、羊、马，甚至蜜蜂的肠道中都有双歧杆菌属，并且大都以优势菌群存在。除齿双歧杆菌B.dentium可能是病原菌外，其他种尚无致病性的报道。在婴儿出生后68天，肠道内即建立起以双歧杆菌占绝对优势的菌群。它们发酵糖类、产生大量的乙酸和乳酸，抑制了具有潜在致病性的大肠杆菌等的生长繁殖，之间到达肠道微生态的平衡。这种平衡状态下

12、的肠菌群对婴幼儿的营养代谢、抗感染及生长发育具有重要意义。双歧杆菌在成年人的肠道中仍然发挥着重要的生理作用，可以起到调整肠菌群失调、治疗肠功能紊乱、抗肿瘤等重要作用，并且还可以起到延年益寿的成效。天然的双歧杆菌菌种可以从动物中别离。猪的胃上皮细胞粘膜附有乳酸菌、大肠杆菌和酵母菌，大肠内含乳杆菌和双歧杆菌的数量可达每克内容物一亿到十亿个。本研究中使用的猪源双歧杆菌就是从健康仔猪的粪便中别离纯化而得的。猪源双歧杆菌具有活性高，增值能力强，有一定的氧耐能力。 研究单位简介广州市微生物研究所是广州市科技和信息化局直属的科研机构，主要从事微生物发酵、生物医药、食品添加剂、防霉防虫和食用菌等领域的技术研究

13、与产品开发，经认定批准为广州市高新技术企业。 开展定位：以微生物发酵为主体，以产品开发和技术效劳为两翼。 本所成立于1972年，原址位于广州市宝岗大道荔福路68号，地处海珠区中心位置，交通便利，占地面积4000多平方米，建筑面积5600多平方米；新址位于广州科学城，占地面积13000多平方米，一期建筑面积8000多平方米。本所拥有中高级职称专业技术人员近30人，初级职称专业技术人员15人。拥有超低温冰箱、冷冻枯燥机、冷冻离心机以及505000发酵罐等一批先进的仪器设备。三十多年来承当各类科研工程120多项，先后有30多个科研工程获得省、部和市级的奖励。1.2 双歧杆菌的益生作用1.2.1 改善

14、人体肠胃道功能双歧杆菌可治疗因大量使用抗生素而导致的伪膜性肠炎。有人采用双歧杆菌制剂治疗伪膜性肠炎380例，临床副作用和复发率均明显降低。双歧杆菌可治疗便秘。双歧杆菌将糖分解后，生成乳酸和醋酸，使肠道呈酸性，其结果能控制由有害菌引起的异常发酵，并且刺激肠蠕动，起到解除便秘的作用。双歧杆菌可治疗慢性腹泻。通过双歧杆菌对慢性腹泻患者临床观察研究说明，在服药两周以后，患者大便次数、形状正常，临床病症消失，其总有效率为90.3%，复发率低。许多国内医院，已将双歧杆菌制剂作为治疗慢性腹泻的首选药物。1.2.2 恢复人体菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康某些内源性菌群，主要是革兰氏阳性杆菌和球菌，与

15、肠粘膜密切结合，在肠粘膜的某些部位形成一层，称为膜菌群，而条件致病性的兼性厌氧菌那么存在于肠腔中。双歧杆菌通过磷壁酸于肠黏膜上皮细胞相互作用密切结合，于其他厌氧菌一起共同占据肠粘膜外表，形成以个生物学屏障，构成肠道的定植抗力，阻止致病菌、条件致病菌的定植和入侵。双歧杆菌在维持正常的肠蠕动方面具有重要作用，而正常的肠蠕动是阻止致病菌在肠道定植的一个重要手段。如使用蠕动抑制剂后，再感染痢疾杆菌可造成致命的后果。无菌动物肠道的蠕动、运送和排空能力均较弱，肠腔内偏碱性，Eh较高。在普通动物肠道中，由于双歧杆菌等专性厌氧菌产酸，肠腔内处于酸性环境，Eh较低，具有调节肠道正常蠕动、维持生理功能的作用。对致

16、病菌的拮抗作用，也是双歧杆菌构成生物屏障的一个重要因素。试管内试验证实它对痢疾杆菌、伤寒杆菌、乙型副伤寒杆菌、变形杆菌、致病性大肠杆菌、产期荚膜梭菌、绿脓杆菌、葡萄球菌以及对某些真菌如白色念珠菌具有拮抗作用，其机理主要是双歧杆菌发酵糖产生大量醋酸与乳酸，降低pH和Eh，抑制致病菌生长。此外，双歧杆菌还产生细胞外糖苷酶，可以降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖。由于这些糖是潜在致病菌的受体，也是结合细菌毒素的受体，所以通过这种酶的作用可以阻止潜在致病菌及其毒素对肠粘膜上皮细胞的粘附。1.2.3 控制人体内毒素的水平，保护肝脏病增强肝脏的解毒、排毒功能人体肠道的有害菌产生并释放毒素进入血液中，对于肝脏会产

17、生很严重的损伤。双歧杆菌制剂可以以致产生毒素的有害菌数量，从而对肝脏患者起到良好的治疗作用。8家国内大型医院采用双歧杆菌制剂对365例慢性肝炎患者进行8周治疗，发现患者肝功能明显改善。双歧杆菌还可以用于治疗肝昏迷，并可以抑制乙肝病毒，促进大三阳、小三阳转阴。1.2.4 降血脂作用，防止动脉硬化和高血压人体血液中，胆固醇含量高会导致动脉硬化和高血压的产生，双歧杆菌等有益菌可以影响胆固醇的代谢，将其转化为人体不吸收的类固醇，降低血液中胆固醇的浓度，因而对高血压和动脉硬化有一定的防治作用。1.2.5 免疫调节作用双歧杆菌具有免疫调节作用，双歧杆菌能激活机体吞噬细胞的吞噬活性，提高抗感染能力，提高人体

18、抵抗力，有缓解失眠、易疲劳或疲劳后难以恢复、易生病等亚健康状况。1.2.6 营养作用牛乳具有丰富的营养，是老年人和婴儿良好的食品。但是中国人中有相当一局部缺乏乳糖酶，不能分解牛乳中的乳糖，这些人饮用牛乳后，常常会出现胃肠功能紊乱，导致胃肠痉挛、胀气或腹泻，迫使这一人群不能饮用牛乳，从而放弃了牛乳中的其他重要成分。而双歧杆菌在乳制品发酵过程中可以产生乳糖酶，帮助患者消化乳糖。乳糖酶缺乏者饮用经双歧杆菌发酵的乳制品，就既可以获得牛乳中丰富的营养，又免受胃肠道病痛之苦。双歧杆菌在人体肠内发酵后可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收。双歧杆菌发酵乳糖产生的半乳糖，是构成脑神

19、经系统中脑苷脂的成分，与婴儿出生后脑的迅速生长有密切的关系。双歧杆菌可以产生维生素B1，维生素B2，维生素B6、维生素B12及丙氨酸、 HYPERLINK :/baike.baidu /view/246341.htm t _blank 缬氨酸、天冬氨酸和苏氨酸等人体的必需营养物质，对于人体具有不容无视的重要营养作用。1.2.7 提高SOD酶活力，消除人体自由基双歧杆菌可以提高SOD酶活力，消除人体自由基，具有抗衰老、延年益寿的作用。欧美和日本的微生态学家调查说明，长寿老人粪便中的双歧杆菌数量与中、青年相当，我国科学家对广西巴玛地区长寿老人的调查也得了相同的结果。双歧杆菌抗衰老的原因，是因为双歧

20、杆菌能抑制腐败菌生长，减少其代谢产物中的氨、硫化氢、吲哚及粪臭素等有害物质的生成。双歧杆菌与一般的药品不同，一般药品是单向治疗，例如降血压、降血脂、治腹泻、治便秘等，其作用是单向的；二而双歧杆菌直接的作用是双向调整的，即可将高的降下来，也可将低的升上去，使用双歧杆菌制剂可以同时治疗腹泻和便秘，使人体恢复正常，这就是调整的作用。1.2.8 抗肿瘤、预防癌症 将大肠杆菌、粪链球菌及两株腐败梭菌的特定菌与无菌小鼠肠联后，造成100%的小鼠发生肝肿瘤。假设上述四株菌再加上肠双歧杆菌与无菌小鼠肠联后，那么使肝肿瘤发生率将由100%下降到46%。上述实验说明，肠道内某些细菌可以产生致癌因子，而另外一些细菌

21、如双歧杆菌可能具有去除这些致癌因子的能力。双歧杆菌还具有降解N-亚硝胺的作用。双歧杆菌除降解致癌因子、抑制肿瘤发生外还对已形成的肿瘤具有抑制作用。康白1987报告青春双歧杆菌DM8504对小鼠H22肿瘤有抑制作用，对小鼠艾氏腹水癌有抗癌活性。将H22瘤细胞接种小鼠，于2d后经尾静脉注射一定量青春双歧杆菌DM8504活菌，每1d一次，连续5d，对照组注射生理盐水。自接种瘤细胞后，16d处死，平均瘤重，试验组与对照组有非常显著差异p蔗糖麦芽糖蜜二糖果糖棉籽糖半乳糖核糖乳糖阿拉伯糖淀粉木糖4.4.2 氮源双歧杆菌由于其对蛋白质分解能力和氨基酸结合能力很弱，因此在培养双歧杆菌时，普遍需向他们提供含各种

22、氨基酸和肽类的有机氮源，包括蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或番茄汁等。4.4.3 生长因子双歧杆菌是一类对生长因子，尤其是维生素依赖性很强的微生物。至今未发现像大肠希氏菌(Escherichia coli)那样能在只含有葡萄糖一种有机物的无机盐培养基上良好生长的双歧杆菌。本研究中采用牛肝浸出液作为生长因子。牛肝浸出液含有丰富的维生素、碱基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺类和各种脂肪酸、矿物质，满足双歧杆菌的生长需要。采用正交实验方法确定双歧杆菌最正确培养基配方。A、B、C、D四个因素，A是氮源，为酵母浸膏、胰蛋白胨和大豆蛋白胨；B为碳源，采用葡萄糖；C为双歧因子低聚果糖；D为生长因子牛肝浸液。表4-3为不同

23、培养基下发酵液的OD600。表4-3 猪源双歧杆菌培养基优化的正交实验结果 L9(34)序号因素指标A(%)B(%)C(%)D(%)OD600pH值10.9 ：0.3：0.61.50.251.7923.7920.9 ：0.3：0.62.00.3102.0073.7730.9 ：0.3：0.62.50.4151.7433.7040.9：0.6：0.61.50.3151.9403.7450.9：0.6：0.62.00.451.9243.7260.9：0.6：0.62.50.2101.9023.7670.9：0.6：0.31.50.4101.9163.7080.9：0.6：0.32.00.2151.

24、8643.7190.9：0.6：0.32.50.352.0913.714.5 测定双歧杆菌的生长曲线基于以上三组已确定的条件，测定双气杆菌的生长状况和产酸情况。测定方法：使用已确定的最正确培养方案培养双歧杆菌，每2小时从摇瓶中用灭菌针筒抽出1mL培养液，用精密pH计测定发酵液pH值。发酵液稀释10倍，使用分光光度计，在600nm处测定吸光度。做10个平行试验。表4-4是根据以上方法测定的OD600值和pH值。表4-4 双歧杆菌的生长情况及pH变化序号发酵时间(h)OD600pH100.3747.19220.6735.93341.3654.52461.4934.37581.6104.256101

25、.6244.117121.6314.098141.6524.069161.6534.0310201.6174.0011221.6093.98根据测定的OD600值和pH值描绘出双歧杆菌的生长曲线，如图4-3。图4-3 双歧杆菌生长曲线及pH变化曲线由由图3.7可见，发酵时间到8h，生长曲线到达最大值，菌体活性高，生命力旺盛，且经济效益高。因此确定发酵生产周期为8h。4.6 本章小结通过进行镜检观察菌体形态、多种生理生化特性实验鉴定、并绘制生长曲线等。研究得出双歧杆菌最适初始pH值为7.2，最适培养温度为35。采用正交实验方法确定双歧杆菌最正确培养基配方为酵母膏0.9%,胰蛋白胨0.6%,大豆蛋

26、白胨0.3%,葡萄糖2.5%,双歧因子低聚果糖0.3%,生长因子牛肝浸液5%。发酵周期为8小时。5 双歧杆菌发酵工艺条件的优化研究5.1 双歧杆菌制剂的生产工艺流程双杆菌生产工艺流程如下：培养及配制灭菌发酵液发酵液培养冷却至40种子培养接种5.2 发酵方案确实定双歧杆菌制剂的生产一般是液体发酵，但对乳酸细菌制剂生产所不同的是双歧杆菌对氧的要求比拟高，而且对厌氧的条件有比拟严格的要求，这就对生产的要求比拟复杂。尽管生产菌种经过耐氧驯化，对氧有一定的耐受性，但并不等于可以不需要厌氧环境。因此，在生产中创造良好的厌氧环境是首要任务。在大规模生产中，通常是在发酵罐中通入氮气或氮、氢和二氧化碳混合气体。

27、5.3 厌氧发酵培养基组成及发酵条件确实定5.3.1 厌氧发酵的培养基组成酵母膏0.9%, 胰蛋白胨0.6%, 大豆蛋白胨0.3%, 葡萄糖2.5%, 双歧因子低聚果糖0.3%, 生长因子牛肝浸液5%。5.3.2 发酵控制条件培养基灭菌后pH7.07.2。种子分别于35摇瓶培养8h后转入100L发酵罐，接种总量10各3.3%，发酵温度3536，发酵时间8h9h，发酵过程缓慢通入混合气体氮气、二氧化碳、氢气，维持罐压0.1kg/cm2以上。5.4 发酵液活菌数的检测双歧杆菌活菌数的测定：按GB/T4789.34-2003测定。操作步骤：以无菌操作讲充分混匀的检样放入含有225mL，灭菌生理盐水的

28、灭菌锥形瓶内作成1:10的均匀稀释液；用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内振摇均匀，做成1:100的稀释液；另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管；选择23个以上适宜稀释浓度，分别在作10倍递增稀释的同时各取0.1mL分别参加技术培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿；同时选用TPY和BBL培养基见附录作检测用，同时作灭菌生理盐水空杯对照；待琼脂平面干后，翻转平皿，放置厌氧罐内，操作全过程须在20min内完成；将厌氧罐置361温箱内培养72h，观察双歧杆菌菌落特征见表5-1；选取菌落

29、在30300之间的平板对可疑菌落进行计数，随机选取五个可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性、革兰氏染色阳性、无芽孢、着色不均匀、出现“Y或“V型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌；表5-1 双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征培养基双歧杆菌特征BBL培养基为黄色菌落中等大小，外表光滑、凸起、边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻TPY培养基为黄色菌落外表光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软细腻菌落计数：根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数；取两种培养基中计数较高的为最终结果；例如，检

30、样1104倍的稀释液在BBL琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个；取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，那么1mL样品中，双歧杆菌数为：10344/5104=2.8106 5.5 10L发酵罐扩大培养试验10升发酵罐的发酵试验结果 (见表5-2)表5-2 三批次10升罐发酵液的活菌数活菌数批次双歧杆菌cfu/ml202104031.2109202104081.7109202104122.0109平均1.6109经过两次对发酵系统进行微调后，发酵效果良好，双歧杆菌产物的数量和质量到达预期效果，发酵液的双歧杆菌活菌数均到达每mL在10亿个以上。将发酵进一步扩大到100升发酵罐进行生产研究试验。5.6

31、100L发酵罐扩大培养试验100升发酵罐的发酵研究结果见表5-3表3-2 三批次100升罐发酵的活菌数活菌数批次双歧杆菌cfu/ml202104161.3109202104201.9109202104251.8109平均1.7109三次厌氧发酵试验中，双歧杆菌活菌数均到达每mL在10亿个以上。厌氧条件良好，双歧杆菌活性高，且无杂菌污染。产量到达根本生产要求，厌氧发酵方案可用于实际生产。5.7 本章小结通过“双歧杆菌生理特性试验得到的发酵培养方案，可用于实际生产。此外，10L扩大培养试验的平均产量比100L扩大培养产量少，初步估计是由于10L发酵罐设备老化，使厌氧环境相对不良而导致的。假设条件允

32、许，可用新的10L发酵罐再进行一次扩大发酵试验，验证发酵方案的可行性。6 结论与展望6.1 结论 本文研究了从仔猪粪便中提取并鉴定出双歧杆菌，并尝试用于生产的相关内容。详细研究了将猪源双歧杆菌用于扩大发酵生产的最正确培养方案，和适宜的生产发酵周期。所得结论如下：烛缸法和焦性没食子酸法结合的厌氧培养方法培养双歧杆菌，厌氧效果良好；培养成功率到达90%以上成功别离双歧杆菌，驯化出的菌种具有一定的氧耐受性通过一系列试验，成功确定了双歧杆菌发酵培养的最正确方案成功描绘出双歧杆菌在最正确发酵方案下的生长曲线，并大致测定了在该方案下的产酸情况通过试验，把发酵生产规模逐步扩大到100升发酵罐。并且发酵结果符

33、合生产要求。6.2 展望双歧杆菌具有很重要的保健成效和医用价值，本研究工作尚属初步，今后可在下述方面进行更为深入和广泛的研究：尝试使用天然培养基，如胡萝卜汁、番茄汁、牛乳等培养基代替合成培养基发酵生产双歧杆菌。进一步以人源双歧杆菌为研究材料，研究其发酵生产方案。并与猪源双歧杆菌的保健和医用成效作比照。进一步研究双歧杆菌产品的包装和保鲜技术，以保证双歧杆菌产品的菌活性。双歧杆菌属放线菌门，由于其形态特征，对剪应力有一定的敏感度。可以从此处入手，进一步研究发酵罐内螺旋桨搅拌功率对双歧杆菌生长的影响。参考文献1李永敬 金苏：?益生菌与健康生活?M中国轻工出版社 20052张刚：?乳酸细菌根底技术和应

34、用?M化学工业出版社 20073陈历俊：?乳品科学与技术中?M国轻工业出版社 20074郭兴华：?益生乳酸细菌分子生物学及生物技术?M科学出版社 20055王顺余：?双歧杆菌的研究现状?J?长春大学学报?2007年08期 第15页6 张明江等：?双歧杆菌用于肿瘤基因治疗的研究现状?J?中国微生态学杂志?2006年02期 第145页7员克勤 张帅清：?焦性没食子酸培养厌氧菌的体会?J?实用预防医学?1996年04期8杨宝兰 冉陆等：?食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验?C?中华人民共和国国家标准 GB/T4789.34-2003?附录I 培养基的配制PTYG培养基：成分：胰胨Tryptone (O

35、xoid)5.0g，大豆蛋白胨5.0g,，酵母粉(Oxoid)10.0g，葡萄糖10.0g，吐-80 1.0mL,琼脂15.0-20.0g， L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，盐溶液4.0mL，蒸馏水1 000.0mL。pH 6.8-7.0制法：将以上成分加热完全溶解，校正pH至6.8-7.0，分装于锥形瓶中，115高压灭菌30min。TPY琼脂培养基：成分：水解酪蛋白10.0g，植物胨5.0g，酵母粉2.0g，葡萄糖5.0g，5%半胱氨酸10.0mL，磷酸氢二钾K2HPO42.0g，氯化镁MgCl26H2O0.5g，硫酸锌ZnSO47H2O0.25g，氯化钙CaCl20.15g，氯化铁FeCl3

36、微量，吐温-80 1.0mL，琼脂20.0g，蒸馏水1 000.0mL。pH6.50.1。制法：将以上成分加热完全溶解，校正pH至6.50.1，分装锥形瓶，115高压灭菌15min20min。BBL琼脂培养基：成分：蛋白胨15.0g，酵母粉 2.0g，葡萄糖20.0g，可溶性淀粉0.5g，氯化钠5.0g，5%半胱氨酸10.0mL，西红柿浸出液400.0mL，吐温-80 1.0mL，肝提取液 80.0mL，琼脂 20.0g，蒸馏水520.0mL。pH7.00.1。制法：西红柿浸出液的制备：将新鲜西红柿洗净称重后切碎，加等量蒸馏水在100水浴中加热，时时搅拌，约90min，然后用绒布过滤，校正pH7.0，分装锥形瓶115高压灭菌15min20min。肝提取液的制备：称取新鲜猪肝1 000g，切成小块，加蒸馏水至2 000mL，混匀，置冰箱中过夜。第二天煮沸15min20min，绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原