常规组织病理学综合实验操作(综V-技术进展）

1、常规组织病理学综 合 实 验 操作(综V-技术进展）实习内容1. 常规组织病理学石蜡切片的操作过程及HE染色 程序实习2. 免疫组织化学技术见习3. 电子显微镜技术多媒体讲解4. 原位多聚酶链反应技术多媒体讲解5. 核酸原位杂交技术多媒体讲解6. 流式细胞技术多媒体讲解7. 生物芯片技术多媒体讲解8. 图像分析术 三、 注意事项1.请课前预习相关综合实验内容。2.学习相关的边缘学科知识-生理学、解剖学 、 病理生理学、细胞生物学等。3. 预习相关的组织学、病理学的理论知识。4.重点掌握疾病的动态演变过程。5.学会运用所学知识，进行综合分析、推理、 判断与鉴别的基本方法。6.掌握运用基础知识解决

2、临床问题的技巧。 大体与常规组织病理学技术 大体观察主要应用肉眼或辅以放大镜、量尺和磅秤等工具，对大体标本的病变性状（行状、大小、重量、色泽、质地、表面及切面形态、与周围组织和器官的关系等）进行细致的解剖、观察、测量、取材和纪录，必要时可摄影留作资料。大体观察不仅是病理医师的基本功和正确病理诊断的第一步，也是医学生学习病理学的主要方法之一。 取材和固定取材和固定用蛋白质凝固剂（常用甲醛）固定新鲜的组织块（多不超过大小）以在很大程度上保存组织的原本结构。 脱水和包埋脱水和包埋把固定好的组织块用酒精脱尽其中的水分;由于酒精不溶于石蜡,故在用二甲苯置换出组织块中的酒精;然后将组织块置于融化的石蜡中,

3、让腊液侵入组织细胞,带冷却后组织偏具有了石蜡的硬度. 切片和染色切片和染色江包有组织的蜡块用切片机切为5-10um的薄偏,贴于载玻片上,脱蜡后进行染色,以提高组织成分的反差,利于观察.追常用的是苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining),简称HE染色法.苏木精染液为碱性,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色. 易于被碱性和酸性染料着色的性质分别称为嗜碱性（basophilia）和嗜酸性（acidophlia）.封片封片切片经脱水等处理后，滴加树胶，用盖玻片密封保存。 特殊1除石蜡切片外，在制作较大组织块（如眼球、脑）的切片时，常用火棉胶包埋。在要进行某些组织化

4、学反应的标本，为保存蛋白质（包括酶）的结构和活性，常把组织块经液氮（196）冷冻后，用恒冷箱切片机切片（冰冻切片）。此外，可将游离的细胞（如血细胞）直接涂于玻片（涂片）；将疏松结缔组织或肠系膜等撕成薄片铺在载玻片上（铺片）；骨和牙等硬组织可磨为薄片（磨片）。 特殊2除HE染色外，还有许多种染色方法，能特异性地显示某种细胞、或细胞外基质成分、或细胞内的某种结构。如用硝酸银将神经细胞染为黑色（镀银染色法，用醛复红将弹性纤维和肥大细胞的分泌颗粒染成紫色。这些染色方法习惯统称为特殊染色。另外，在取动物组织材料之前，为显示某种细胞，还可进行活体染色，即将无毒或毒性小的染料经静脉注入后,在取材制成切片观察

5、。如注入的台盼蓝（trypan blue）科被肝、脾等器官内的巨噬细胞吞噬，这些细胞内含有了大量蓝色颗粒而易于辨认。 显微镜观察以上方法制备的标本一般使用普通光镜进行观察，这是组织病理学研究的最基本技术。通常光学显微镜可放大1500倍左右，分辨率为。常用计量单位为微米（um），1微米（micrometer，um）=1/1000毫米（milimeter，mm）。在组织化学术，常使用荧光燃料染色或作为标记物，用荧光显微镜（fluorescence microscope）观察。荧光显微镜以紫外线为光源，能激发燃料发出荧光。在细胞培养术，一般光镜不易分辨无色透明的活细胞，需用相差显微镜（phase c

6、ontrst microscope）才能观察。相差显微镜可将厚细胞不同或度及细胞内各种结构对光产生的不同折射，转换为光密度差异（明暗差），从而使镜下结果反差明显，影像清晰。 诊断将肉眼确定为病变的组织取材后，以福尔马林(formalin，甲醛)溶液固定和石蜡包埋制成切片，或将脱落细胞制成涂片，经不同的染色方法染色后用光景显微镜观察。通过分析或综合病变特点，可作出疾病的病理诊断。组织切片最常用的染色方法是苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)。迄今，这种传统的方法仍然是诊断和研究疾病的最基本的方法。如仍不能诊断或需进一步研究时，则可辅以一些特殊染色和新技术。 组织化学与

7、免疫组织化学技术 组织化学(histochemistry )一般称为特殊染色，通常应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分（如蛋白质、酶类、核酸、糖类、脂类等），同时又能保存原有的形态改变，达到形态与代谢的结合。对一些代谢性疾病的诊断有一定的参考价值，例如在戈谢(Gaucher)病，由于先天性葡萄糖脑苷脂酶缺乏，致使大量葡萄糖脑苷脂在脾脏和肝脏的组织细胞中堆积，可用组织化学染色加以证实。在肿瘤的诊断和鉴别诊断中也可用特殊染色方法。如过碘酸Schiff反应（PAS）可区别Ewing肉瘤和恶性淋巴瘤，前者含有糖原而呈阴性。缄钨酸苏木精染色(PTAH)可

8、显示横纹肌肉瘤中瘤细胞胞质内的横纹。 组织化学术(histochemistry )组织化学术(histochemistry )为应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术,与组织学技术相结合而产生的技术,能在组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否、以及分布状态.还可进一步用显微分光光度计或图象分析仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获得定量的信息.应用这种技术于游离细胞的样品(如细胞涂片),则称细胞化学术(cytochemistry ). 一般组织化学术一般组织化学术 基本原理是在切片上加某种试剂,和组织中的待检物质发生化学反应,其最终产物或为有色沉淀物,以用光镜观察,或为重金

9、属沉淀,以用电镜观察. 糖类:常用过碘酸希夫反应(periodic acid Schiff reaction ,PAS 反应)显示多糖和糖蛋白的糖链.糖被强氧化剂.过碘酸氧化后,形成多醛;后者再与无色的品红硫酸复合物(即希夫试剂)结合,形成紫红色反应产物. 脂类:标本用甲醛固定,冷冻切片,用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料染色,使脂类(脂肪、类脂)呈相应颜色.亦可用锇酸固定兼染色,脂质呈黑色. 核酸:核酸:显示DNA的传统方法为孚尔根反应(Feulgen reaction) .切片先经稀盐酸处理,使DNA分解;再用希夫试剂处理,形成紫红色反应物.如果同时显示DNA和RNA,则用甲基绿-派若宁反

10、应.甲基绿与细胞核DNA结合呈蓝绿色,派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色. 酶类:酶类:旨在通过显示酶的催化活性来表明酶的存在.程序是将切片置于含特异性底物的溶液中孵育,底物经酶的作用形成初级反应产物,它再与某种捕捉剂结合,形成显微镜下可见的沉淀物,即最终反应物.例如显示酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液(pH 5.0)中孵育,底物经酶水解,释放磷酸;用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应,形成细微的磷酸铅,沉淀于酶存在的部位,此时可在电镜下观察(经超薄切片技术加工后);如在用硫化铵处理,磷酸铅被置换形成粗颗粒状地黑色硫化铅沉淀物，便可用光镜看到。由于酶都是蛋白质，故近年来更多

11、采用免疫组织化学术显示。 免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织和细胞中的某些化学物质的一门技术，它是免疫学和传统组织化学相结合而形成的。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 1.免疫组织化学染色方法1.免疫组织化

12、学染色方法 HIC染色方法有很多种，按部标记物的性质可分为荧光法（荧光素标记），酶法（辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶），免疫金银及铁标记技术等；按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步，三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物（labeled dextran polymer,LDP）法，以及亲和连接，如ABC法、标记的链亲和素-生物素（labeled streptoavidin-biotin ,LSAB）法等，其中LSAB是最常用的使用方法。 2.免疫组化染色的质量控制和结果解析2.免疫组化染色的质量控制和结果解析 HIC中常用的抗原表达模式有以下几

13、种：细胞质内弥漫性分布。如脑垂体前叶ACTH等各种细胞功能成分和滤泡细胞等均为弥漫性胞质染色；细胞核周的胞质内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚；胞质内局限性点状阳性，如CD15抗体的染色；细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；细胞核阳性，如Ki-67及雌孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞质和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞质内弥漫性阳性反应；CD30抗体可同时呈膜性和胞质内点状阳性反应等。 影响免疫组化染色质量的因素影响免疫组化染色质量的因素很多，在实验中应注意组织的取材和固定，选择质量好的商品化抗体，恰当的选择和使用封闭和抗

14、原修复手段，严格的技术操作和对照等。由于组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过底、或固定剂的使用不当及抗体质量不佳和稀释度不当等可出现假阴性反应；反之，由于抗体与非待检抗原发生交叉反应，或组织对抗体的非特异性吸附及内源性过氧化酶（endogenousperoxidase）没有被阻断等还可出现假阳性结果。这些可造成判断的失误。 免疫组织化学染色技术的应用商品化3.免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多克隆抗体的出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组织化学染色已经成为医学基础研究盒病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。HIC克用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属

15、性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋王的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。免疫组织化学染色技术也是以后发展起来的非放射性原位杂交，原位PCR和原位末端标记DNA片断等技术的基础。 电子显微镜技术电镜标本的制备由于电镜的分辨率高，因此电镜样本的处理和超薄切片的制作技术比光镜制片更为精细和复杂，电镜样本的制备与常规病理制片不同之处有以下几点：要求组织新鲜，选择无坏死，无出血有代表性的区域进行小块多取材。组织厚度可为12，再修成1的小块，每个样本至少要取4到5块；双重组织固定，常用的化学固定剂有锇酸，醛类固定剂和高锰酸甲等，所谓双重固定，如先用戊二醛固定

16、，再用锇酸固定，固定液的PH值应小于；组织包埋用环氧树脂；1m厚的半薄切片经甲苯胺蓝或HE染色进行组织定位；用玻璃刀切制超薄切片，切片厚度为6080nm；重金属盐染色，如醋酸铀或枸酸铅等。 电镜技术的应用电镜技术的应用电镜技术的应用领域很宽，在声明科学领域可用与胚胎及组织发生学方面的援救和观察，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点；临床上可用于多种疾病亚细胞结构变化的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断，以及一些疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定，如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断；最早关于细胞凋王的形态学描述也是源于电镜的观察。电镜技术也有其局限性，有时还可

17、能遗漏信息；当用于辅助肿瘤外检诊断时，只能判定组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性质。 原位多聚酶链式反应 原位多聚酶链式反应技术是多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术的一部分， 原位PCR技术原位PCR技术 原位PCR技术有直接法原位PCR，间接法原位PCR，原位反转录PCR(in situ reversetranscription-PCR)和原位再生式序列复制反应(self-sustained sequence relication reaction,3SR)等方法，其中应用较广泛的是间接原位PCR方法。其主要程序有组织固定，预处理（如蛋白酶K

18、和RNA酶消化），原位扩增及扩增产物的原位杂交和检测等。由于使用原位杂交技术对扩增产物做检测，使该方法的特异性较直接法高。 原位PCR技术的应用及目前存在的问题原位PCR技术能用于低拷贝的内源性基因的检测和定位，在完整的细胞样品上能检测出单一拷贝的DNA序列，可用于基因突变，基因重组和染色体易位等的研究和观察。还可用于外源性基因的检测和定位，如对各种感染性疾病病源的基因检测，如EB病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒基因组及结核、麻风杆菌基因的检测等，在临床上还可应于对接受了基因治疗患者体内导入基因的检测等。从理论上讲，原位PCR是一个较完美的技术，兼有较高的敏感性和基因

19、的细胞内定位功能，但该技术目前还欠完善，主要表现在以下几个方面：特异性不高，特别是假阳性的问题。可能产生假阳性的原因有引物扩增序列的弥散等。提高其检测结果的特异性，必须设计酶处理后样品的阴性对照等；技术操作复杂，影响因素太多；需要特殊的设备，即原位PCR仪，多为进口，价格昂贵，加之技术上存在的问题等，短时间内还难于在国内大面积推广使用，但有一定的潜在使用前景。 核酸原位杂交技术 原位杂交（in situ hybridization,ISH）是核酸分子杂交的一部分，是将组织化学与分子生物学技术相结和来检测和定位核酸的技术。它是用标记了的已知序列的核苷酸片断作为探针(probe)，通过杂交直接在组

20、织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。其生物化学基础是DNA变性，复性和碱基互补配对结和。根据所选用的探针和待检靶序列的不同，有DNADNA杂交、DNARNA杂交和RNARNA杂交。 探针的选择和标记用于原位杂交的探针有双链cDNA探针，单链cDNA探针，单链cRNA探针和合成的寡核苷酸探针等。一般而言，探针的长度以50300个碱基为宜，用于染色体原位杂交的探针可为。探针标记物有放射性核素3H、35S、32P等，这类探针的敏感性高，但有半衰期和放射性污染，成本也高且耗时，故其使用受限；非放射性核酸标记物有荧光素，地高辛和生物素等，尽管其敏感性不如放射性标记

21、探针，但因其性能稳定，操作简便，成本低和耗时短等长处，正越来越广泛的得到应用。对双链cDNA的探针的标记可用缺口平移或随机引物法；单链cRNA探针可通过转录进行标记；合成寡核苷酸探针可用5末端标记法。 原位杂交的主要程序原位杂交的实验材料可以是常规石蜡包埋组织切片，冰冻组织切片，细胞涂片和培养细胞爬片等。主要程序包括杂交前准备、预处理、杂交、杂交后处理清洗和杂交体的检测等。操作中应注意的问题有：对DNARNA杂交和RNARNA杂交，需进行灭活RNA酶处理水（包括的二乙基焦碳酸盐（diethylpyrocarbonate,DEPC）配制有关试剂和160180烘烤实验用器皿等）；当使用双链cDNA

22、探针和或待测靶序列是DNA时，需进行变性处理使DNA解链；杂交温度应低于杂交体的解链温度（Tm）25左右；对照实验：原位杂交较免疫组化染色复杂，影响因素颇多，故对照实验是必不可少的，有组织对照，探针对照，杂交反应体系和检测系统对照等，可根据具体情况选用。 荧光原位杂交可以用直接法或间接法进行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH），前者是以荧光素直接标记已知DNA探针，在桥连一个荧光标记的抗体。FISH检测的靶序列也是DNA，即是一种DNADNA杂交。FISH的探针有不同的类型，如重复序列探针，位点特异性探针和全染色体探针等，是FISH技术

23、得到越来越多的应用。 原位杂交技术的应用原位杂交可应用于：细胞特异性mRNA转录的定位，可用于基因图谱，基因表达和基因组进化的研究；感染组织中病毒DNARNA的检测和定位，如EB病毒的mRNA、人类乳头状瘤病毒和巨细胞病毒DNA的检测；癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测；基因在染色体的定位；检测染色体的变化，如染色体数量异常和染色体易位等；分裂间期细胞遗传学的研究，如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定，某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。原位杂交和免疫组化染色技术相比较，IHC使用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测

24、；FISH使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待检靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。二者均有较高的敏感性和特异性，但FISH更容易受到外界因素影响。 流式细胞技术 流式细胞技术（flow cytomertry,FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。 流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪由三部分构成：传感系统，包括样本传递系统、样品池、检测系统、电子传感器和激光源等；计算机系；电路、光路和水路系统、有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分等。流式细胞仪的工作原理是

25、使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒一个个地依次通过样品池，细胞的流速可达9m秒，同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角，侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号，经计算机处理形成相应的点图，直方图和假三维结构图像进行分析。 样本制备的基本原则用于FCM的样本是单细胞悬液，可以是血液，悬浮细胞培养液，各种体液，如胸水，腹水，脑脊液，新鲜实体瘤的单细胞悬液，以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。样本制备基本原则是：使各种体液和悬浮细胞样本新鲜，尽快完成样品制备和检测；针对不同的细胞样本进行适当的洗涤，酶消化或EDTA处理，以清除杂质，使黏附的细胞彼此分离而成单细胞状态；对新鲜实体瘤组

26、织可选用或联用酶消化法，机械打散发和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液。常用的酶有胃蛋白酶，胰蛋白酶和胶原酶三种；对石蜡包埋组织应先切成若干4050m厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到水后，再选用前述方法制备单细胞悬液；单细胞悬液的细胞数应不少于10。 流式细胞术的应用流式细胞仪具有精密、准确、快速和高分辨能力等特性，具体表现以下几个方面：其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；能准确的进行DNA倍体分析；借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；快速进行细胞分选和细胞收集。流式细胞术在医学基础研究和临床检测中有多方面的应用，如外周细胞的免疫表型测定和定量分析，某一特定细胞群的筛选和细

27、胞收集、细胞多药耐药基因的检测、癌基因、抑癌基因的检测、细胞凋亡的定量研究，细胞毒功能检测以及细胞内某些蛋白质和核酸的定量分析等。应注意的问题是单细胞样本的质量直接影响FCM检测结果，一般而言，新鲜细胞或组织样本优于已固定组织样本。 生物芯片技术生物芯片技术（biochip technique）是近年来才发展起来的生物医学高新技术的一种，包括基因芯片，蛋白质芯片和组织芯片等。 基因芯片（gene chip） 基因芯片（gene chip）又称DNA芯片(DNA chip)，是指固着在固相载体上的高密度的DNA微点阵，具体的说就是将大量的靶基因或寡核苷酸片断有序列地，高密度地（点与点间距一般小于

28、500m）排列在如硅片、载玻片、聚丙烯或尼龙膜等载体上，这就是基因芯片。一套完整的基因芯片分析系统包括芯片阵列仪、激光扫描仪、计算机及生物信息软件处理系统等。基因芯片技术是由美国斯坦福大学医学中心生化系Brown教授领导的研究小组在1995年首先报道的。 基因芯片的分类和工作原理基因芯片的分类和工作原理 按基因芯片的功能可将其分为三类：即表达谱基因涂片、诊断芯片和检测芯片，前者主要应用于基因芯片的研究；后者可应用于遗传病、代谢病和某些肿瘤的诊断或病源微生物检测等。表达谱基因芯片检测的基本原理是：用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织的mRNA分别标记制成探针，将探针混合后与芯片上的DNA片断

29、进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。 基因芯片的应用基因芯片的应用 基因芯片技术可用于生命科学研究的各个领域，在基础研究方面有基因表达谱分析、基因分型、基因突变的检测、新基因的寻找、遗传作图和重测序等；在临床上可应于抗生素和抗肿瘤药物的筛选和疾病的诊断等方面。利用基因芯片人们可以大规模，高通量地对成千上万骼基因同时进行研究，从而解决了传统的核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、操作数量少和检测效率低等问题。通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析方法使该技术具有广阔的应用前景。应用基因芯

30、片技术要求实验材料是从新鲜组织或培养细胞中提取的mRNA，对外周血或培养细胞样本的研究相对容易，对实体瘤的研究受到限制。 蛋白质芯片（protein chip）蛋白质芯片（protein chip）又称蛋白质微阵列（protein microarray），它是继基因芯片之后发展起来的对基因功能产物表达水平检测的技术。蛋白质芯片也是在一个载体上点布高密度不同种类的蛋白质，再用荧光标记的已知抗体或配体与待测样本中的抗体或配体一同同芯片上的蛋白质竞争结合，在扫描仪上读出荧光强弱，再经计算机分析计算出待测样本结果。最近，德国科学家Lueking等率先利用机械手段将基因工程生产的92种不同种类的人体蛋白质点印在聚二氟亚乙烯滤片上，用相应的单克隆抗体测试。以后，随着蛋白质芯片技术的不断完善，检测容量已达一万三千多个点，并实现了整个过程全自动化检测，具有高效率、低成本的特点，尤其适用于蛋白表达的大规模、多种类筛查、并能用于