食管癌外来体中miRNA表达谱的初步分析#

1、中国科技论文在线- PAGE 9 - FORMTEXT 食管癌外来体中miRNA表达谱的初步分析基金项目：国家自然科学基金(81172747, 81072259, 30800891, 30671732)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(BK2010407)；东南大学优秀青年教师教学科研资助计划(2009) FORMTEXT 盛静逸， FORMTEXT 刘冉， FORMTEXT 郭丽娟， FORMTEXT 廖娟， FORMTEXT 杨淼， FORMTEXT 尹立红作者简介：盛静逸（1987-），女，硕士在读，主要研究方向：环境肿瘤基因通信联系人：尹

2、立红（1963-），女，教授，主要研究方向：肿瘤环境病因学、环境卫生学. E-mail: lhyinSET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFOR

3、MAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET ve

4、rsion 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET bkCompanyEN Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineer

5、ing, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Minis

6、try of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Edu

7、cation, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009 * MERGEFORMATKey Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of

8、Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education,

9、 School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009;Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of

10、 Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009SET bkCompanyCHN 东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009 * MERGEFORMAT东南

11、大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009;东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009SET bkPostcode 210009;210009 * MERGEFORMAT210009;210009SET bkMobile13951080846 *

12、 MERGEFORMA13951080846SET bkTelphone025-83272583 * MERGEFORMA025-83272583SET bkAddress 东南大学公共卫生学307;东南大学公共卫生学院 * MERGEFORMAT东南大学公共卫生学307;东南大学公共卫生学院SET bkEmail shengjingyi;ranliu;105764098;444281224;309685041;lhyin * MERGEFORMATshengjingyi;ranliu;105764098;44428

13、1224;309685041;lhyinSET bkIntroduction 盛静逸（1987-），女，硕士在读，主要研究方向：环境肿瘤基因。;尹立红（1963-），女，教授，主要研究方向：肿瘤环境病因学、环境卫生学。 * MERGEFORMAT盛静逸（1987-），女，硕士在读，主要研究方向：环境肿瘤基因。;尹立红（1963-），女，教授，主要研究方向：肿瘤环境病因学、环境卫生学。SET bkAuthorCHN 盛静逸;刘冉;郭丽娟;廖娟;杨淼;尹立红 * MERGEFORMAT盛静逸;刘冉;郭丽娟;廖娟;杨淼;尹立红SET bkAuthorEN Sheng Jingyi;Liu Ran;G

14、uo Lijuan;Liao Juan;Yang Miao;Yin Lihong * MERGEFORMATSheng Jingyi;Liu Ran;Guo Lijuan;Liao Juan;Yang Miao;Yin LihongSET bkContact 尹立红 * MERGEFORMAT尹立红SET bkFund 国家自然科学基金(81172747, 81072259, 30800891, 30671732)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(BK2010407)；东南大学优秀青年教师教学科研资助计划(2009) * MERGEFORMAT国

15、家自然科学基金(81172747, 81072259, 30800891, 30671732)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(BK2010407)；东南大学优秀青年教师教学科研资助计划(2009)SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 *

16、 MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET version 1.5 * MERGEFORMAT1.5SET bkReferencesInfo 1*|*期刊*|*任微娜,常春康,范华骅. 外来体在肿瘤免疫治疗中的研究进展J. 内科理论与实践,2009,4:66-68.2*|*期刊*|*王

17、锴佳, 唐建华. 肿瘤来源的外体及其在肿瘤中的作用J. 中南大学学报,2010,35:1288-1292.3*|*期刊*|*曲晶磊,曲秀娟,赵明芳. 胃癌细胞来源的exosomes 对肿瘤细胞增殖的影响J. 现代肿瘤学,2010,18:2315-2319.4*|*期刊*|*邱悦,邱雪杉. miRNA的研究进展J. 研究进展,2010,7:14-16.5*|*期刊*|*唐仪. miRNA与肿瘤的研究进展J. 国际病理科学与临床杂志,2010,30:53-56.6*|*期刊*|*Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, et al. Let-7 microRNA family

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19、体（exosome）在肿瘤免疫治疗中的应用J. 生物技术通讯,2009,20:243-245.10*|*期刊*|*张靖.张庆瑜. PI3K/Akt和COX2 信号通路阻断在胃癌治疗中的应用J. 世界华人消化杂志,2009,17: 584-588.11*|*期刊*|*赵明芳,曲晶磊,曲秀娟等. 胃癌细胞来源的exosome的提取和鉴定N. 中国医科大学学报,2008,37:500-502.12*|*期刊*|*Hadi Valadi, Karin Ekstr. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism

20、 of genetic exchange between cellsJ nature cell biology.2007,9:654-670.13*|*期刊*|*Zomer A, Vendrig T Hopmans ES, et al.Exosomes Fit to deliver small RNAJ Landes Bioscience.2010, 3(5): 447-450. * MERGEFORMAT1*|*期刊*|*任微娜,常春康,范华骅. 外来体在肿瘤免疫治疗中的研究进展J. 内科理论与实践,2009,4:66-68.2*|*期刊*|*王锴佳, 唐建华. 肿瘤来源的外体及其在肿瘤中的

21、作用J. 中南大学学报,2010,35:1288-1292.3*|*期刊*|*曲晶磊,曲秀娟,赵明芳. 胃癌细胞来源的exosomes 对肿瘤细胞增殖的影响J. 现代肿瘤学,2010,18:2315-2319.4*|*期刊*|*邱悦,邱雪杉. miRNA的研究进展J. 研究进展,2010,7:14-16.5*|*期刊*|*唐仪. miRNA与肿瘤的研究进展J. 国际病理科学与临床杂志,2010,30:53-56.6*|*期刊*|*Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, et al. Let-7 microRNA family is selectively secrete

22、d into the extracellular environment via exosomes in a metastatic gastric cancer cell lineJ. PLoS One, 2010, 5(10): 1-10.7*|*期刊*|*刘宝瑞, 谢丽. miRNA:新一代肿瘤生物标志J.临床肿瘤杂志,2010,15:1-5.8*|*期刊*|*刘辉, 刘冉,苏耀耀. 淮安食管癌与癌旁组织中差异表达microRNAs的初步分析J. 癌变,畸变,突变.2010,22(06):418-422. 9*|*期刊*|*李秋文,肖文华. 外体（exosome）在肿瘤免疫治疗中的应用J.

23、 生物技术通讯,2009,20:243-245.10*|*期刊*|*张靖.张庆瑜. PI3K/Akt和COX2 信号通路阻断在胃癌治疗中的应用J. 世界华人消化杂志,2009,17: 584-588.11*|*期刊*|*赵明芳,曲晶磊,曲秀娟等. 胃癌细胞来源的exosome的提取和鉴定N. 中国医科大学学报,2008,37:500-502.12*|*期刊*|*Hadi Valadi, Karin Ekstr. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange be

24、tween cellsJ nature cell biology.2007,9:654-670.13*|*期刊*|*Zomer A, Vendrig T Hopmans ES, et al.Exosomes Fit to deliver small RNAJ Landes Bioscience.2010, 3(5): 447-450.SET bkAuthorsInfo |1|盛静逸|Sheng Jingyi|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Minis

25、try of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|盛静逸（1987-），女，硕士在读，主要研究方向：环境肿瘤基因。|东南大学公共卫生学307|210009|shengjingyi13913999073|2|刘冉|Liu Ran|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education,

26、School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|ranliu|3|郭丽娟|Guo Lijuan|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|105764098|4|廖娟|Liao Juan|东南大

27、学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|444281224|5|杨淼|Yang Miao|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry

28、of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|309685041|*|6|尹立红|Yin Lihong|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|尹立红（1963-

29、），女，教授，主要研究方向：肿瘤环境病因学、环境卫生学。|东南大学公共卫生学院|210009|lhyin13951080846 * MERGEFORMAT|1|盛静逸|Sheng Jingyi|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|盛静逸（1987-

30、），女，硕士在读，主要研究方向：环境肿瘤基因。|东南大学公共卫生学307|210009|shengjingyi13913999073|2|刘冉|Liu Ran|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|ranliu|3|郭丽娟|Guo Lijuan|东南大

31、学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|105764098|4|廖娟|Liao Juan|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry

32、of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|444281224|5|杨淼|Yang Miao|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|309685041|*|6

33、|尹立红|Yin Lihong|东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009|Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009|尹立红（1963-），女，教授，主要研究方向：肿瘤环境病因学、环境卫生学。|东南大学公共卫生学院|210009|lhyin13951080846SET bkTitleInfo 食管

34、癌外来体中miRNA表达谱的初步分析|Expression profile of exosomal miRNAs derived from esophageal cancer cells|国家自然科学基金(81172747, 81072259, 30800891, 30671732)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(BK2010407)；东南大学优秀青年教师教学科研资助计划(2009) * MERGEFORMAT食管癌外来体中miRNA表达谱的初步分析|Expression profile of exosomal miRNAs derived f

35、rom esophageal cancer cells|国家自然科学基金(81172747, 81072259, 30800891, 30671732)；高等学校博士学科点专项科研基金(200802861045)；江苏省自然科学基金(BK2010407)；东南大学优秀青年教师教学科研资助计划(2009)（东南大学公共卫生学院环境医学工程教育部重点实验室，南京，210009）SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT 摘要： FORMTEXT 目的:从食管癌细胞株（KYSE150,EC9706）培养上清中分离获得外来

36、体(exosomes)，分别提取外来体及细胞中的总RNA，建立外来体和细胞中miRNA（microRNA）表达的差异谱，从而为筛选与外来体功能相关的miRNA提供线索。方法:通过低速、高速及超速离心的分步离心法，从食管癌细胞培养上清中分离exosomes，用透射电子显微镜观察其形态特征；用mirVana miRNA Isolation Kit 分别提取细胞和exosomes中的总RNA；实时荧光定量PCR检测细胞和exosomes 中14种在食管鳞癌与癌旁组织中差异表达的miRNA(miR-183, miR-21*, miR-139-5p, miR-144, mir-338-3p, miR-1

37、55, miR-574-5p, miR-192, miR-218, miR-601, miR-623, miR-186, miR-20a, miR-145)的相对表达水平。结果: 在筛选的14个miRNA基因中，除了miR-20a外，其余13个基因在食管癌细胞与其exosomes中的表达均有较大差异；不同细胞株（KYSE 150，EC9706）对比，除miR-144和miR-155外，其余12个基因的外来体及细胞的表达谱在不同细胞株间存在较大差异；其中miR-186在9706细胞来源的exosomes中显著高表达。结论: 外来体的miRNA表达谱与其来源的细胞miRNA表达谱有显著差异，且具有

38、细胞特异性。在外来体中特异表达的miRNA可能与外来体的细胞间通讯功能有关，其功能可能通过外来体的传递作用介导受体细胞的靶基因调控。关键词： FORMTEXT 食管癌；外来体；miRNA；表达谱中图分类号： FORMTEXT R12SET bkAuthorsInfo * MERGEFORMAT SET bkTitleInfo * MERGEFORMAT FORMTEXT Expression profile of exosomal miRNAs derived from esophageal cancer cells FORMTEXT Sheng Jingyi, FORMTEXT Liu Ra

39、n, FORMTEXT Guo Lijuan, FORMTEXT Liao Juan, FORMTEXT Yang Miao, FORMTEXT Yin Lihong(Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering, Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, China,Nanjing,210009)Abstract: FORMTEXT 【Objective】To extract exosomes from the cell culture

40、 supematant of esophageal cancer cell line（KYSE150,EC9706）and to explore the miRNA (microRNA) expression profile of exosomes.【Methods】 Exosomes were extracted from cell culture supematants by multiple centrifugation. Morphology of exosomess was observed with transmission electronic microscopy. Total

41、 RNAs of cell and exosomes were extracted by mirVana miRNA Isolation Kit. Levels of fourteen miRNA(miR-183, miR-21*, miR-139-5p, miR-144, miR-338-3p, miR-155, miR-574-5p, miR-192, miR-218, miR-601, miR-623, miR-186, miR-20a and miR-145), previously demonstrated to be differentaly expressed in esopha

42、geal cancer tissues and compared normal tissues, were compared in cell and exosomes.【Results】Except for miR-20a, the other miRNAs in exosomes showed different expression compared with esophageal cancer cells. The differential expression profile between cell and exosomes was dependent on cell line. E

43、xcept for miR-144 and miR-155, the other miRNAs showed significantly different expression between KYSE150 and EC9706. Moreover, miR-186 was the only miRNA that showed an increased expression in exosomes compared with cell.【Conclusion】 The miRNA expression profile in exosomes is different from that i

44、n cell. It also is dependent on cell line. The specific miRNAs expressed in exosomes are suggested to play an important role in intercellular communication mediated by exosomes.Key words: FORMTEXT esophageal cancer; exosomes; miRNA; expression profile引言外来体（exosomes） 是细胞内多囊泡体膜内陷形成，并与细胞膜融合，分泌到胞外的膜性囊泡状

45、小体。许多细胞都能够分泌exosomes，其中包括肿瘤细胞，上皮细胞，造血细胞1。在exosomes中包含生物分子，如蛋白质，mRNA，microRNA，这些分子能够通过exosomes被转移到受体细胞中，并将其所携带的信息（如癌细胞抗原信息，或者是免疫应答信息）传递过去2。由于肿瘤细胞来源的exosomes表面含有MHC类分子和肿瘤抗原，因此认为exosomes具有抗肿瘤作用。近来一些研究发现，exosomes在一定条件下可以下调免疫应答或诱导免疫耐受，同时在肿瘤细胞的恶性增殖方面也起着一定的作用3。microRNA（miRNA)是一类长度为1825个核苷酸的非编码小分子RNA4。miRNA

46、 在基因转录后水平上通过与靶mRNA互补结合，抑制mRNA的翻译或降解mRNA，发挥对人类蛋白的表达调节作用。miRNA参与细胞的生长、分化和细胞周期调控等多个环节5，最近研究证据表明，肿瘤来源miRNA是肿瘤特异的功能性miRNA，miRNA的突变或异常表达与人类的多种癌症有关，这表明miRNA可能发挥着致癌基因或抑癌基因的作用6，成为肿瘤细胞间通讯的新介质。miRNA具有很好的组织特异性和阶段特异性，同一种肿瘤在发生发展的不同分期阶段具有不同的miRNA表达谱，展示了miRNA作为肿瘤标志物的巨大潜能7。我们之前的研究显示8，食管鳞癌组织与其配对癌旁组织样品相比表达差异有显著意义的micr

47、oRNA分子有14个，其中表达上调的有7个，分别为miR-20a，miR-155，miR-574-5p，miR-21*，miR-183，miR-601，miR-623 ，表达下调的有8个，分别为miR-186，miR-10a，miR-144，miR-338-3p，hsa-miR-192， miR-218，miR-139-5p，提示该14个miRNA可能与食管鳞癌的发生和发展相关。 本次研究中，为明确食管癌细胞来源exosomes中miRNA的表达特征，对该14种miRNA在食管癌细胞与其分泌exosomes中的表达水平进行分析，筛选与外来体功能相关的miRNAs，寻找新的食管癌肿瘤标志物。材料

48、与方法材料食管癌细胞株KYSE150，EC9706，超高速冷冻离心机（美国Beckman公司），透射电镜（日本Hitachi公司），mirVana miRNA Isolation Kit试剂盒（美国Ambion公司），ABI 7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司），SYBR Green I Master Mix（日本Toyobo公司）；miRNA基因特异性逆转录及上下游扩增引物（U6，miR-183，miR-21*，miR-139-5p，miR-144，miR-338-3p，miR-155，miR-574-5p，miR-192，miR-218，miR-601， miR-623，miR-18

49、6， miR-20a，miR-145）购自广州锐博生物技术有限公司。方法细胞培养细胞生长在含青、链霉素各100 U / mL，10% 胎牛血清的RP-MI 1640 完全培养液中，于37含5%CO2 细胞培养箱中常规培养。隔日传代，待细胞生长至对数期，用2. 5 g/ L 胰蛋白酶消化收集细胞，PBS 洗涤重悬9。所有实验均取用对数生长期的细胞。细胞培养所用血清需经脱exosomes处理，去除exosomes采用两步法分离10，即10，000 g30 min，100，000 g60 min。Exosomes的分离与鉴定食管癌细胞株（KYSE150,EC9706）培养48 h 后收集细胞上清液6

50、0ml用于exosomes的制备。首先，收集的上清液通过一系列离心去除细胞及碎片: 4，300g 10min、1，200g 20min、10，000g 30min，收集上清。然后100，000 g离心60 min，收集沉淀；PBS 洗涤后，再次100，000 g离心60 min，收集沉淀；50l PBS 重悬沉淀，收集备用。取exosomes20 L 悬液滴于载样铜网上，于室温静置1 min；用滤纸从侧面吸干液体，滴加20 gL磷钨酸(pH 68)约30 L于铜网上，室温负染1 min；用滤纸吸干负染液，在白炽灯下烤干后，于透射电镜下观察并照相11。分离RNA按照mirVana miRNA I

51、solation Kit试剂盒的步骤分别提取exosomes和细胞的总RNA。逆转录PCR以两步法行逆转录PCR ( reversetranscription PCR，RT-PCR)。第一步：总RNA1-2g；62.5nM特异性RT引物（U6，miR-183，miR-21*，miR-139-5p，miR-144，miR-338-3p，miR-155，miR-574-5p，miR-192，miR-218，miR-601，miR-623，miR-186，miR-20a，miR-145）2.0l；补去离子水至11l；反应条件：7010min，冰育2min。第二步：5MMLV buffer5.0l；2

52、.5mM dNTP2.0L；Rasin 抑制剂(40U/L)0.5L；MMLV(200U/L)0.5L；去离子水 6L；反应条件：42 60min，70 10min。逆转录的cDNA -20保存备用。预扩增以cDNA 为模板进行PCR扩增。cDNA1L；5M miRNA上下游引物（U6，miR-183，miR-21*，miR-139-5p，miR-144，miR-338-3p，miR-155，miR-574-5p，miR-192，miR-218，miR-601， miR-623，miR-186，miR-20a，miR-145）各1.6L；10*easy taq buffer 2.0L；2.5m

53、M dNTP1.6L；EasyTaq DNA polymerase 0.2L；去离子水12L。反应条件：955min（94 30s，6030s，72 30s）12循环；725min。实时荧光定量PCR实时定量PCR反应体系包括：SYBR Green I Mastermix 9.0 L，RT产物2.0L，5M miRNA上下游引物（U6，miR-183，miR-21*，miR-139-5p，miR-144，miR-338-3p，miR-155，miR-574-5p，miR-192，miR-218，miR-601，miR-623，miR-186，miR-20a，miR-145）各2L，去离子水5L

54、。将总共体积为20L的混合反应物按照说明书的步骤做实时荧光定量PCR。扩增按以下步骤操作：95oC5min,40循环（95oC15s，60oC29s，72 oC29s）。所有样品采用两复孔。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct 值, 以U6作为内参照, 采用定量PCR 中的相对定量法，以Ct= Ct目的基因-Ct U6表示各目的基因以U6作为对照的相对表达量。Ct=外来体(Ct目的基因-Ct U6) -细胞(Ct目的基因-Ct U6)， 表示食管癌细胞与其exosomes中miRNA的表达差异。以N=2-Ct 表示食管癌细胞中miRNA表达相对于其exosomes的

55、变化倍数。结果透射电镜下食管癌细胞exosomes的形态图 SEQ 图表 * ARABIC 1 食管癌EC 9706细胞来源的exosomes的电镜下形态Fig. 1 Transmission electron microscopy profile of exosomes 实时荧光定量PCR分析结果不同细胞来源的exosome及其相应细胞中，14种在食管癌与癌旁组织中差异表达的miRNA基因表达相对于U6基因的Ct值比较如图2 (A、B)所示。可以看出，除mir-183在EC9706细胞中缺失，其余差异表达的miRNA分子在不同细胞来源的exosomes 中均可检测到。在KYSE150细胞来源

56、的exosomes中，除miR-20a表达水平与细胞相似外，其它miRNA的表达水平均显著低于KYSE150细胞；EC9706来源的exosome中，mir-186表达显著高于细胞中的表达水平，其余各miRNA基因在其EC9706来源的exosomes中表达均显著低于EC9706细胞。 由3（A、B）可见，KYSE150来源的exosome中，miR-192， miR-338-3p， miR- 155，miR-601，miR-218， miR-21*， miR-623，miR-145，miR-139-5p，miR-574-5p，miR-144的表达水平仅为细胞中相应miRNA表达水平的10%或

57、更低；miR-20a在KYSE150来源的exosome中表达水平与细胞接近，提示miR-20a可能参与了KYSE150来源的exosome介导的细胞间通讯作用。在EC9706来源的exosome中，miR-183表达缺失，miR-192, miR-155, miR-21*， miR-145，miR-623，miR-218， miR-574-5p， miR-144， miR-139-5p， miR-601的表达水平仅为细胞中相应miRNA表达水平的10%或更低，miR-20a的表达水平与细胞中的表达水平接近，而miR-186的表达显著高于细胞中miR-186的表达水平，这一结果表明miR-18

58、6和miR-20a可能参与了EC9706来源的exosome介导的细胞间通讯作用，尤其是在exosome中选择性高表达的miR-186可能在EC9706来源exosome介导的细胞间通讯中起着更为重要的作用。由图3（C）可见，exosome和细胞间的miRNA差异表达谱在不同细胞株表现为不同的特征。miR-338-3p在KYSE150的exosome中表达较低，miR-183在EC9706的exosome中表达缺失，而miR-186在该exosome中选择性高表达，miR-20a在KYSE150和EC9706的exosome中均有较高水平的表达，这些差异表达特征提示选择性表达的miRNA在不同

59、细胞来源的exosome中可能参与了细胞间通讯的不同功能，介导了多通路的受体细胞靶基因调控。 A B图 SEQ 图表 * ARABIC 2 食管癌细胞与其exososmes 中14种miRNA基因表达水平比较Ct= Ct目的基因-Ct U6，表示各目的基因以U6的表达量作为对照的相对表达量。（A）KYSE 150细胞株（B）EC 9706细胞株。Fig. 2 Expression profiles of miRNA in cell and exosomes Ct values normalized against U6 miRNA levels were calculated, represe

60、nting the relative expression levels of 14 target miRNAs. (A) KYSE150 cell and exosomes. (B) EC9706 cell and exosomes.A BC图3 不同细胞株及相应外来体中miRNA表达差异比较Ct=外来体(Ct目的基因-Ct U6) -细胞(Ct目的基因-Ct U6)，表示食管癌细胞与其exosomes中miRNA的表达差异。（A）KYSE 150（B）EC 9706（C）KYSE 150与EC 9706细胞株比较。Fig. 3 Comparison of miRNA expression