CYPC基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性

1、CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究 答 辩 人：罗 静指导教师：童卫杭 主管药师1主要内容研究背景1实验方法2实验结果3分析讨论42第一部分 研究背景药物耐受及低药效毒副作用及不良反应AEDs需合理的临床个体化用药传统的“标准化用药”癫痫第二大神经系统顽症一线抗癫痫药（AEDs）体内代谢个体差异大3丙戊酸钠（Sodium Valproate, VPA）一线抗癫痫药，目前仍无法取代可用于多种类型的癫痫发作图1.丙戊酸分子结构Fig.1 molecular structure of valproic acid相线粒体内-氧化 相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT)的酸化 细胞色素P4

2、50酶(CYP450)的代谢 未发现相关酶的基因多态性UGT酶基因的突变位点及突变频率未知CYP2C19中国人群突变率较高，突变位点研究成熟药代动力学（PK）复杂，个体差异大体内代谢途径相关酶的基因多态性研究CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值4CYP2C19最主要的两个突变位点 CYP2C19*2:第5外显子681位 GA CYP2C19*3:第4外显子636位 GA 基因型鉴定：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR：模拟体内DNA复制条件，体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，以扩增目的DNA。 RFLP：某种限制性内切酶特异性识别位

3、点，对DNA切割； 基因突变时特异性酶切位点消失，不被限制性内切酶切断； 利用电泳检测，观察条带分析基因型。 PCR-RFLP特点：操作简便，耗时耗费低 本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性产生终止密码，过早终止蛋白合成，产生无活性CYP2C19酶，降低对丙戊酸代谢5第二部分 实验方法一、数据收集2008年9月至2009年4月第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部服用丙戊酸钠的癫痫患者49例筛选资料齐全的30例记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血药浓度、合并用药等情况。 二、血药浓度检测荧光偏振免疫法（FIP） 美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免

4、疫测定仪及配套试剂盒服用丙戊酸至少5个半衰期（2-2.5天）后，血药浓度达稳态时，于下次服药前，采抗凝静脉血4ml。离心，取上清液（血浆）100l，进样测定。6三、基因型鉴定1、提取DNA: 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒提取所收集血样DNA 北京六一仪器厂DYY-II2型电泳仪和电泳槽DNA样品电泳检测紫外灯下判读结果，照相存档2、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）2.1 PCR反应 德国Eppendof公司PCR扩增仪设计并合成CYP2C19引物： CYP2C19*2:前引物F 5-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3 后引物R 5-ACAAATAC

5、GCAAGCAGTC-3 CYP2C19*3:前引物F 5-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3 后引物R 5ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3 7建立反应体系： 蒸馏水9 l 前引物0.5 l，后引物0.5 l HotStar Taq Master Mix 12.5 l（包含4种dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶，以及TrisCl-KCl缓冲液） DNA 模板2.5 lPCR反应条件： CYP2C19*2：94预变性15min94变性40s51退火30s72延伸30s 循环35次，最后72延伸10min。产物长度458bp CYP2C19*3：94预变性15min94

6、变性30s56退火30s72延伸30s循环35次，最后72延伸10min。产物长度233bp。PCR产物电泳检测 紫外灯下判读结果，目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验 照相存档82.2 限制性长度多态性（RFLP） 美国New England Biolabs公司内切酶SmaI 、 BamHI酶切反应： CYP2C19*2：用限制型内切酶SmaI30消化3h。SmaI酶切条件：PCR反应产物10ul；水16ul；10Buffer 2ul；SmaI 2ul。 CYP2C19*3：用限制型内切酶BamHI37消化3h。BamHI酶切条件：PCR反应产物10ul；水18ul；10Buffer

7、BamHI 2ul；BamHI 1ul。酶切产物电泳检测 紫外灯下判读结果，通过条带数目及位置，判断基因型 照相存档3、基因测序 取前引物6l，与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列 四、数据分析Spss 12.0 standard version(Spss Inc.)用双侧t检验和2检验。P0.05为差异有统计学意义 9第三部分 实验结果一、病人一般情况和治疗情况男20例，女10例，男女比例2:1平均年龄33.624.60岁，平均体重56.1518.50kg丙戊酸钠体重剂量范围2.3-27.7mg/kgd,平均值为11.74mg6.10/kgd血药浓度范围7.97-89.96g/ml,平均

8、值为44.5927.60g/ml二、血药浓度监测情况测定血药浓度样品150例次血药浓度有效范围：40-100g/ml低于有效浓度低限共65例次超过有效浓度高限共2例次10三、全血基因组DNA提取与PCR扩增产物1、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组DNA条带结果2000bp目的条带Marker图2.琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNAFig 2. Apparent DNA ladder shown by agarose gel electrophoresis112、CYP2C19*2、CYP2C19*3 PCR扩增结果 CYP2C19*2 PCR产物长度458bp500bp458bp目的条带Ma

9、rker图3.琼脂糖凝胶电泳检测CYP2C19*2PCR产物Fig3. PCR amplification of CYP2C19*2 shown by agarose gel electrophoresis12 CYP2C19*3 PCR产物长度233bp250bp233bpMarker目的条带图4.琼脂糖凝胶电泳检测CYP2C19*3PCR产物Fig4.PCR amplification of CYP2C19*3 shown by agarose gel electrophresis 目的条带清晰，无非特异性扩增条带，说明PCR扩增较为理想，符合研究要求。13四、基因型判定1、限制性片段长度

10、多态性法CYP2C19*2突变位点：681GA 当等位基因为681G时，SmaI酶将片断切开成为272bp和186bp两条片断 当等位基因为681A时，酶切位点消失，片段不被切开据此分析酶切结果，判断基因型，见图5： GG基因型，也称野生型-272、186bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-458、272、186bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-458bp一条片断 14500bpAA型AG型GG型458bp 272bp186bpMarker图5.CYP2C19*2分型Fig5.Genotype of CYP2C19*2（AA为突变纯合型，GG为野生型，AG为突变杂合型）(AA h

11、omozygous type, GG wild type, AG heterozygous type)15CYP2C19*3突变位点：636GA 当等位基因为636G时，BamHI酶将片断切开成为137bp和96bp两条片断 当等位基因为636A时，酶切位点消失，片段不被切开据此分析酶切结果，判断基因型，见图6： GG基因型，也称野生型-137、96bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-233、137、96bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-233bp一条片断16250bp233bp137bp96bpGG AGMarker图6.CYP2C19*3分型Fig6.Genotype of

12、CYP2C19*3（GG为野生型，AG为突变杂合型）(GG wild type, AG heterozygous type)172、基因测序法图7.基因测序图谱从测序图谱分析：在突变位点只有G峰的，为GG型在突变位点只有A峰的，为AA型在突变位点有G和A双峰的，为AG型限制性片段长度多态性分析结果与基因测序结果一致两种DNA鉴定方法相互验证，证明所建立的限制性片段长度多态性法准确、可靠18五、等位基因和基因型分布1、基因频率与基因型 CYP2C19*2的基因频率与基因型统计结果见下表19 CYP2C19*3的基因频率与基因型统计结果见下表202、双位点基因型 理论上应该有九种双位点基因型： C

13、YP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GG（纯合野生，无突变） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GA（*2纯合野生，*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 GG（*2杂合子，*3纯合野生） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 GG（*2纯合突变，*3纯合野生） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 AA（*2纯合野生，*3纯合突变） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 GA（*2杂合子，*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 AA（*2杂合子，*3纯合突变） CYP2C19*2

14、AA - CYP2C19*3 GA（*2纯合突变，*3杂合子） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 AA（*2纯合突变，*3纯合突变）21由于样本量的限制，在此次研究中，只发现了*2GG-*3GG,*2GA-*3GG,*2AA-*3GG,*2GG-*3GA,*2GA-*3GA五种双位点基因型。各基因型频率分布见下表表3.双位点基因型频率分布Tab.3 Frequency distribution of genotype双位点基因型频率*2GG*3GG40.7%*2GA*3GG44.4%*2AA*3GG3.7%*2GG*3GA7.4%*2GA*3GA3.7%22六、CYP2C19基

15、因型与丙戊酸血药浓度的相关性血药浓度/体重剂量血药浓度标准化，排除服药剂量和体重对血药浓度的影响进行基因型与血药浓度/体重剂量相关性分析，结果如下1、各种基因型与血药浓度的关系单独分析CYP2C19*2基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGAAA单独分析CYP2C19*3基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGA带有突变的基因型比值均高于野生基因型，但差异没有统计学意义，见表4232、各种双位点基因型与血药浓度相关性研究发现，5种双位点基因型中，血药浓度/体重剂量比值大小顺序为： *2GG-*3GG *2GG-*3AG *2AG-*3GG ，见表5（其中*2AG-*3

16、AG和*2AA-*3GG都只有1例） *2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG，其他基因型比值均高于*2GG-*3GG，但结果没有统计学差异表5.CYP2C19双位点位点基因型与血药浓度相关性双位点基因型血药浓度/体重剂量*2GG-*3GG3.551.76*2GG-*3AG3.690.61*2AG-*3GG4.362.83*2AG-*3AG4.98*2AA-*3GG4.22 24第四部分 分析讨论一、关于实验技术的讨论用于药物代谢酶基因多态性研究的基因分型方法 限制性片段长度多态性（RFLP）分析基因测序法单链构象多态性分析（SSCP）变性高效液相色谱（DHPL

17、C）分析变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析其中，基因测序法结果精准，但费用较高，不适于临床样品常规检测 DHPLC法目前已不单独使用，多为结合其他技术作辅助使用25优点操作简单低耗时耗费经基因测序结果验证，准确可靠限制性片段长度多态性（RFLP）分析缺点要具有已知的内切酶的识别位点只能检测已知的酶切位点，而对基因的所有突变位点无法全面检测此法适于临床样品的常规检测在建立一种新的PCR-RFLP法时，最好用基因测序法予以验证26二、关于实验结果的讨论1、基因频率与基因型 本研究所得各种基因型与双位点基因型的频率，均与文献报道相似（CYP2C19基因多态性对癫痫患者丙戊酸血药浓度的影响，北大药学院，

18、于洁，邵宏等） 基因突变率较高，证实中国人群中研究CYP2C19基因多态性与血药浓度的相关性，有临床研究价值。2、基因型与血药浓度的相关性基于样本量不足，我们对数据进行分析没有统计学差异但在研究中发现*2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG，因此可以认为CYP2C19基因多态性影响丙戊酸血药浓度*2GG-*3AG的血药浓度/体重剂量比值较之*2AG-*3GG，与*2GG-*3GG较接近，是因为*3位点上的基因突变率较*2位点的低。 在临床使用中，携带*2AG-*3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸血药浓度会明显升高，若要达到某一目标血药浓度，携带*2AG-*3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸剂量应减少2