硕士论文答辩华中科技大学

1、斑马鱼核糖体蛋白RPL5和RPL11缺陷致使再生障碍性贫血样病征的分子机制(jzh)研究答辩人：学科专业：指导教师：2014.1.6华中科技大学生命科学与技术学院人类(rnli)基因组研究中心提纲研究背景实验流程结果与讨论小结与展望致谢共三十一页研究(ynji)背景再生障碍性贫血（Diamond-Blackfan anemia, DBA）骨髓是人体最重要的造血器官，骨髓造血干细胞及造血微环境的损害必然会引发造血功能不足的相关病征，严重威胁着人类健康。DBA是一种临床主要表现为贫血的遗传性骨髓衰竭综合征，通常在婴儿期或儿童早期出现病征；主要来自(li z)于红细胞发育以及正常血小板和骨髓系统如造

2、血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）不足。Alter BP, Young NS. The bone marrow failure syndromes. Hematology of infancy and childhood, 1998, 1: 237-335.在英国和荷兰的研究发现，每一百万新生儿就有4-5名患病，同时也有证据显示该病具有显性遗传性，潜在发病率可能在12-25。Ball S, McGuckin C, Jenkins G, Gordon-Smith E. Diamond-Blackfan anaemia in the UK: analysis of

3、 80 cases from a 20-year birth cohort. British journal of haematology ,1996, 94(4): 645-653.共三十一页核糖体蛋白缺陷与DBA核糖体是细胞中最古老的分子机器，为生命活动必须。核糖体由不同(b tn)的核糖体蛋白RPs和rRNA分别组成核糖体大、小亚基，直至大、小装配形成完整的核糖体。Wool IG. The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annual review of biochemistry, 1979, 48(1): 719-754.

4、Wool IG, Chan Y-L, Glck A. Structure and evolution of mammalian ribosomal proteins. Biochemistry and Cell Biology, 1995, 73(11-12): 933-947.首次发现的由于核糖体蛋白（RPS19）结构缺陷致使DBA，且是最频繁的突变核糖体蛋白基因，占大约25%的DBA患者。随着研究的不断深入，越来越多的基因突变编码编码的核糖体亚单位，如小型核糖体蛋白RPS19, RPS24, RPS17, RPS7, RPS10, RPS26以及大型核糖体蛋白RPL5, RPL11, RP

5、L35等已被证明会导致DBA。Draptchinskaia N, Gustavsson P, Andersson B, et al. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. Nature genetics, 1999, 21(2): 169-175.Dianzani I, Loreni F. Diamond-Blackfan anemia: a ribosomal puzzle. Haematologica, 2008, 93(11): 1601-1604.共三十一页p53途

6、径与RPS异常P53蛋白家族参与细胞应激反应，作为(zuwi)抑癌基因对细胞的生长分化起重要作用。机体内MDM2蛋白通过与P53蛋白相互作用维持着较低的恒定水平。Vogelstein B, Lane D. Surfing the p53 network. Nature, 2000, 408(6810): 307-310.Ryan KM, Phillips AC, Vousden KH. Regulation and function of the p53 tumor suppressor protein. Current opinion in cell biology, 2001, 13(3)

7、: 332-337.研究证实RPs包括rRNA的合成与核糖体亚基组装的异常都会影响成熟核糖体的形成，并且通过核仁应力的调节启动p53途径。Azuma M, Toyama R, Laver E, et al. Perturbation of rRNA synthesis in the bap28 mutation leads to apoptosis mediated by p53 in the zebrafish central nervous system. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(19): 13309-13316. Zhang

8、Y, Lu H. Signaling to p53: ribosomal proteins find their way. Cancer cell, 2009, 16(5): 369-377.共三十一页细胞(xbo)损伤，外界压力等p53途径(tjng)会被激活细胞周期阻滞细胞衰老凋亡MDM2蛋白催化P53蛋白泛素化P53蛋白的下调反式激活阻碍P53蛋白对其反式激活核仁应作用异常核糖体蛋白与MDM2结合P53蛋白抑制抑制抑制共三十一页PI3K通路和MAPKs通路与血液生成有丝分裂原活化激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)家族参与机体内多种信号机制，其中(qzhng) MEK/ERK

9、 和 PI3K/AKT信号通路在多种生长因子、激素、细胞因子的刺激（如造血细胞因子）下，最终分别通过磷酸化活化的ERK和AKT，激活或抑制其下游靶各种蛋白，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等。研究表明，造血细胞因子、生长因子、趋化因子以及通过与细胞外基质和基质细胞相互作用协调控制骨髓微环境中的造血作用。这些刺激引起的细胞内信号事件整合，通过MEK/ERK 和 PI3K/AKT信号通路，从而调节各种血细胞的增殖、存活、分化以及其迁移至骨髓。Arai A, Jin A, et al. SDF-1 synergistically enhances IL-3-induced activation

10、 of the Raf-1/MEK/Erk signaling pathway through activation of Rac and its effector Pak kinases to promote hematopoiesis and chemotaxis. Cellular signalling, 2005, 17(4): 497-506.Hammerman PS, Fox CJ, Birnbaum MJ, et al. Pim and Akt oncogenes are independent regulators of hematopoietic cell growth an

11、d survival. Blood, 2005, 105(11):4477-4483.Shelton JG, Steelman LS, Lee JT, et al. Effects of the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT signal transduction pathways on the abrogation of cytokine-dependence and prevention of apoptosis in hematopoietic cells. Oncogene, 2003, 22(16): 2478-2492.共三十一页以斑马鱼为模型的DBA研究斑马鱼

12、作为模式生物，与哺乳类相比，其重要器官发生中的许多关键作用分子以及重要事件在进化和功能方面都有很强的保守性。尤其实在胚胎发育，血液发生直至引发DBA病征的研究中得到广泛应用。Jing L, Zon LI. Zebrafish as a model for normal and malignant hematopoiesis. Disease Models & Mechanisms, 2011, 4(4): 433-438.在RPS19异常会通过激活p53途径引发人类红系始祖细胞的发育缺陷；RPS29基因(jyn)异常通过p53途径阻碍造血干细胞以及红系祖细胞的形成；在RPS7基因抑制的斑马鱼模

13、型中，p53途径被激活，从而引发下游靶基因反应和生物事件包括细胞凋亡和细胞周期阻滞的发生，以相同方法同时下调p53基因可以部分回补该异常表型。Dutt S, Narla A, et al. Haploinsufficiency for ribosomal protein genes causes selective activation of p53 in human erythroid progenitor cells. Blood, 2011, 117(9): 2567-2576.Taylor AM, Humphries JM, et al. Hematopoietic defects i

14、n rps29 mutant zebrafish depend upon p53 activation. Experimental Hematology, 2012, 40(3): 228-237.Duan J, Ba Q, Wang Z, et al. Knockdown of ribosomal protein S7 causes developmental abnormalities via p53 dependent and independent pathways in zebrafish. The international journal of biochemistry & ce

15、ll biology, 2011, 43(8): 1218-1227.共三十一页有关RPL5和RPL11异常与DBA的研究近期有大量临床数据分析显示(xinsh)，DBA患者中有10.1%的RPL5基因突变和6.5%的RPL11基因突变，并且在该患者中没有发现RPS19或是RPS24基因突变。 Gazda HT, Sheen MR, Barras N, et al. Mutations of the genes for ribosomal proteins L5 and L11 are a common cause of Diamond-Blackfan anemia. In: Blood,

16、2007. AMER SOC HEMATOLOGY 1900 M STREET. NW SUITE 200, WASHINGTON, DC 20036 USA: 130A-131A.Cmejla R, Cmejlova J, Handrkova H, et al. Identification of mutations in the ribosomal protein L5 (RPL5) and ribosomal protein L11 (RPL11) genes in Czech patients with DiamondBlackfan anemia. Human mutation, 2

17、009, 30(3): 321-327.通过基因型及表型分析发现，大约有20%的患者筛查出带有RPL5或者RPL11编码基因突变。Quarello P, Garelli E, Carando A, et al. Diamond-Blackfan anemia: genotype-phenotype correlations in Italian patients with RPL5 and RPL11 mutations. Haematologica, 2010, 95(2): 206-213.RPL5和RPL11异常与p53途径关系密切Marechal V, Elenbaas B, Piet

18、te J , et al. The ribosomal L5 protein is associated with mdm-2 and mdm-2-p53 complexes. Molecular and cellular biology, 1994, 14(11): 7414-7420.Zhang Y, Wolf GW, Bhat K, , et al. Ribosomal protein L11 negatively regulates oncoprotein MDM2 and mediates a p53-dependent ribosomal-stress checkpoint pat

19、hway. Molecular and cellular biology, 2003, 23(23): 8902-8912.共三十一页注射RPL5 MO和RPL11 MO获取RPL5 和RPL11 缺陷的斑马鱼胚胎模型检验(jinyn) RPL5 MO和RPL11 MO功效RPL5和RPL11缺陷的斑马鱼生物信息学分析不同物种(wzhng)的RPL5和RPL11序列比对以及系统进化树分析RPL5 和RPL11 缺陷的斑马鱼全基因组RNA-Seq数据分析RPL5 和RPL11 缺陷对血液生发的影响O-染色，苏丹黑B-染色血液相关探针的胚胎整体原位杂交p53途径与斑马鱼中RPL5和RPL11缺陷致

20、使的造血功能不足RPL5 MOp53 MO共注射组和RPL11 MOp53 MO共注射组O-染色，苏丹黑B-染色血液相关探针的胚胎整体原位杂交RT-PCR分析定量血液相关标记基因的表达PI3K通路和MAPKs通路与RPL5和RPL11缺陷致使的造血功能不足蛋白质免疫印迹初步检测其中pERK和pAKT蛋白表达量变化实验流程共三十一页结果(ji gu)与讨论有报道(bodo)，DBA病征还表现为生长阻滞和先天性畸形，尤其是在颅面、上肢、心脏、泌尿系统中出现缺陷。Gazda HT, Sheen MR, et al. Ribosomal protein L5 and L11 mutations are

21、 associated with cleft palate and abnormal thumbs in Diamond-Blackfan anemia patients. The American Journal of Human Genetics, 2008, 83(6): 769-780.10hpf时期的RPL11 MO注射的胚胎出现外包明显减慢，甚至往后的发育过程中，到尾牙期无法外包，或者外包30%后停止，直至死亡（如图4 G）；48hpf时期的胚胎，RPL5 MO注射的胚胎出现腹部的尾鳍少量减少，背部、尾部下垂，卵黄偏大等轻度畸形（如图4 E,F）；48hpf时期RPL11 MO注射

22、组有约20%的胚胎出现较严重畸形，胚胎腹部尾鳍完全缺失，且尾部卷曲，头部缩小，卵黄增大明显。RPL5 和RPL11 缺陷对斑马鱼胚胎形态特征的影响共三十一页检验 RPL5 MO和RPL11 MO功效检验 RPL5和RPL11 Morpholino功效的重组(zhn z)质粒的构建结果经PCR产生一个与RPL5和RPL11基因(jyn)各自mRNA 5 非编码区（UTR区）片段，其中包括相应的MO靶区和部分RPL5和RPL11基因非编码和编码序列相对应的cDNA片断，并将该片段定向克隆进载体pEGFP-N1多克隆位点，载体中EGFP序列的ATG起始密码子被去除，以使插入片段与EGFP序列形成融合

23、表达分子。Waldo GS, Standish BM, Berendzen J, et al. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein. Nature biotechnology, 1999, 17(7): 691-695Wood AW, Schlueter PJ. Targeted knockdown of insulin-like growth factor binding protein-2 disrupts cardiovascular development in zebrafish embryos. M

24、olecular Endocrinology, 2005, 19(4): 1024-1034.共三十一页共注射(zhsh)检验RPL5和RPL11 Morpholino功效RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+Control MO注射组发出较明显的绿色荧光（如图A,C,E,G），说明该质粒在胚胎正常表达绿色荧光蛋白，而RPL targeted morpholino-pEGFP-N1+RPL11 MO注射组几乎(jh)没有绿色荧光。证实注射的RPL5 MO和RPL11 MO能与斑马鱼细胞中RPL5 和RPL11对应的mRNA起始密码子区域互补结合共三十一页RPL5和R

25、PL11缺陷的斑马鱼生物信息学分析不同(b tn)物种的RPL5和RPL11序列比对以及系统进化树分析RPL5和RPL11蛋白(dnbi)前136个氨基酸序列z指斑马鱼 zebrafish/Danio rerio； h 指人类Homo sapiens；m指小家属Mus musculus；g指原鸡Gallus gallus；x指爪蟾Xenopus laevis；d指果蝇Drosophila melanogaster；a指拟南芥Arabidopsis thaliana共三十一页氨基酸序列系统(xtng)进化树分析共三十一页updownsumRPL11 MO vs. Control51122173R

26、PL5 MO vs. Control102203305RPL5 和RPL11 缺陷(quxin)的斑马鱼全基因组RNA-Seq数据分析cirh1a, nat10, noc2l, dkc1, abce1, tars, polr1b, ahsa1, pwp2h, pdcd11, nol6, aatf等重要节点基因表达(biod)异常RPL5RPL11铁代谢以及亚铁血红素合成不足血红蛋白合成障碍血液生发障碍血液生发相关信号通路造血干细胞生成障碍alas2, tfa, and tfr1b等基因表达异常共三十一页RPL5 和RPL11 缺陷(quxin)对血液生发的影响 RPL11和RPL5缺陷(qux

27、in)的斑马鱼体与对照组O-染色共三十一页Chen AT, Zon LI. Zebrafish blood stem cells. Journal of cellular biochemistry, 2009, 108(1): 35-42.血液(xuy)相关探针的原位杂交共三十一页 RPL5和RPL11缺陷的斑马鱼体与对照组苏丹(sdn)黑B-染色共三十一页 探针制备(zhbi)所需质粒线性化产物回收电泳以及合成的RNA探针回收后电泳6s时期的对照组和RPL5缺陷(quxin)的斑马鱼体gata1,scl,pu1变化共三十一页 24hpf时期(shq)的对照组和RPL5和RPL11缺陷的斑马鱼

28、体gata1, scl, pu1变化共三十一页 36hpf和48hpf时期(shq)的对照组和RPL5和RPL11缺陷的斑马鱼体c-myb, runx1变化 36hpf和48hpf时期的对照组和RPL5和RPL11缺陷(quxin)的斑马鱼体c-myb, runx1变化共三十一页p53途径(tjng)与斑马鱼中RPL5和RPL11缺陷 致使的造血功能不足 对照组，RPL缺陷(quxin)的斑马鱼体和RPL MOp53 MO共注射组O-染色共三十一页 对照组，RPL缺陷(quxin)的斑马鱼体和RPL MOp53 MO共注射组苏丹黑B-染色共三十一页 6s时期的对照组，RPL 缺陷的斑马鱼体和R

29、PL MOp53 MO共注射(zhsh)组gata1,scl,pu1表达变化 共三十一页 36hpf和48hpf时期(shq)的对照组，RPL缺陷的斑马鱼体和RPL MOp53 MO共注射组runx1, c-myb变化 共三十一页 血液相关探针的胚胎整体原位杂交RT-PCR分析(fnx)定量血液相关标记基因的表达c-myb，runx1：标记造血干细胞；mpx：标记髓系造血细胞，尤其是粒系（成熟的嗜中性粒细胞和嗜酸性(sun xn)粒细胞）；ikzf1：标记淋系造血细胞始祖细胞（T细胞，B细胞，NK细胞形成）；efnb2a：标记动脉早期形成；Spi1：标记髓系（粒系细胞，单核细胞，巨噬细胞）；Kdrl：标记血管早期形成。共三十一页PI3K通路和MAPKs通路与RPL5和RPL11缺陷 致使的造血功能(gngnng)不足蛋白质免疫印迹(yn j)初步检测其中pErk和pAkt蛋白表达量变化共三十一页小结(xioji)和展望通过MO