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文档简介
1、第八章 荧光免疫技术Immunofluorescence Technique荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合起来的一种免疫分析技术。 Coons等于1941年首次采用异硫氰酸荧光素标记抗体,检测小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原而获得成功。1970年后发展建立起了荧光免疫测定技术(fluorescence immunoassay,FIA)。近年来,荧光免疫技术标准化、定量化和自动化阶段。荧光免疫技术分为两大类:荧光抗体染色技术荧光免疫测定 荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结
2、果,称为荧光免疫显微技术,或是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术;第一节 荧光标记物的制备一、荧光和荧光物质二、荧光标记物的制备(一) 荧光1荧光的产生: 一些化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能)而进入激发态,当其从激发态再回复至基态时,过剩的能量以荧光形式释放出来。光致荧光化学荧光X线荧光或阴极射线荧光。e电子荧光高能级基态激发态2荧光效率 荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率。荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,而是或多或少地以其他形式释放。3. 荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。4荧光的
3、淬灭 指荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。这是由于激发态分子的电子不能回复到基态,所吸收的能量无法以荧光形式发射所致。5影响因素 (1)pH (2)温度(3)荧光素的浓度 (4)杂质对细胞荧光染色的影响 (5)某些细胞固定剂对细胞荧光染色的影响 (6)苯胺、酚、硝基苯及一些卤化物影响 (二)荧光物质1常见荧光素(1)异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC) (2)四乙基罗丹明(rhodamine,RB200) (3)四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) (4)
4、藻红蛋白(phycoerythrin,PE) 2其他荧光物质(1)镧系稀土元素 (2)酶作用后产生荧光的物质 二、荧光标记物的制备(一)荧光素标记物的制备1荧光素标记抗体的方法2荧光素标记抗体的纯化3荧光素标记抗体的鉴定(二)镧系稀土元素标记物的制备第二节 荧光免疫显微技术Immunofluorescent Microscopy Technique一、基本原理荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具,用荧光素标记特异性抗体或抗抗体,检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体,常用于定性和定位检查的一门技术。二、技术类型根据标记物和反应程序的不同,可将荧光免疫显微技术分为直接法、间接法、补体结合法和
5、双标记法等四类。1直接法用荧光素标记特异性抗体,将特异性荧光抗体直接滴加于待测标本上,直接与相应抗原反应(图18-1)。此法常用于细菌和病毒等病原微生物的快速检测、肾活检及皮肤活检的免疫病理检查。2间接法用荧光素标记抗球蛋白抗体(抗抗体),待基质标本中的抗原与相应抗体(第一抗体)反应,再用荧光素标记的抗抗体(第二抗体)结合第一抗体,通过荧光现象检查抗原或抗体(图18-2)。此法常用于检测各种自身抗体。3补体结合法用荧光素标记抗补体抗体,待基质标本中的抗原与抗体反应后,加入补体,补体和抗原抗体复合物结合,再加入荧光素标记的抗补体抗体,通过荧光现象检查抗原或抗体(图18-3)。4双标记法用两种荧光
6、素 (FITC和RB200) 分别标记不同抗体,对同一标本进行荧光染色,若有相应的两种抗原同时存在,在荧光显微镜下用两种不同的激发光,同时显示两种荧光(黄绿色和橘红色荧光),方法与直接法相同。本法主要用于同时观察细胞表面两种抗原的分布与消长关系,区分末梢血或同一切片中T和B细胞等。三、技术要点 荧光免疫显微技术主要包括标本的制作、荧光抗体染色和荧光显微镜检查等步骤:(一)标本的制作(二)荧光抗体染色(三)荧光显微镜检查 (一) 标本的制作在制备标本过程中,应力求保持抗原的完整性。在染色和洗涤等过程中不发生溶解和变性,也不扩散至临近细胞或组织间隙中去。 常见的临床标本材料主要有组织、细胞和细菌三
7、大类 。涂片、印片或切片 。除活细胞外,其他标本片应在染色前以适当方式固定 (二) 荧光抗体染色在已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体,置带盖的湿盒内,在一定温度下温育一定时间,一般以2537温育30min。不耐热抗原的检测则以4过夜为宜。温育后充分洗涤干燥。(三) 荧光显微镜检查 经荧光抗体染色的标本,需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检,以防荧光消退,影响结果。荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。 荧光显微镜与普通显微镜的不同之处在于光源、滤光片、聚光器及镜头等。注意事项 1.非特异性荧光染色是直接影响检测结果的主要问题。 2.对照:阳性对照即为已知的阳性对照。阴性对照包括
8、:用与特异性抗体种属相同的动物血清或同一动物免疫前的血清标记荧光素代替特异性抗体,结果应为阴性。染色抑制试验:将未标记荧光素的抗体先与切片的靶抗原反应,然后再加荧光素标记的相同抗体,结果应为弱阳性或阴性。用PBS代替荧光抗体,结果应为阴性。标本自发荧光对照,即切片标本经PBS洗后不加荧光抗体,应为阴性。四、方法评价荧光免疫显微技术可用于组织学中抗原或抗体的定位、定性检查,既有抗原抗体反应的高度特异性,又能在荧光显微镜下清晰地显示其形态,直观性强。其缺点是荧光容易消退,难以制备永久性标本,非特异荧光的干扰常影响结果的判断。五、临床应用 荧光免疫显微技术在临床检验中已用作细菌、病毒和寄生虫的检验及
9、自身免疫病的诊断等1血清中自身抗体的检测 2各种微生物的快速检查和鉴定 3寄生虫感染的诊断 4白细胞分化抗原的检测 5. 人类白细胞抗原(HLA)、肿瘤组织中肿瘤抗原、组织中免疫球蛋白和补体组分、激素和酶的组织定位等的检测。第三节 荧光免疫测定技术 fluorescence immunoassay Technique1.非均相荧光免疫测定法:时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay, TR-FIA)荧光酶免疫测定(fluorescence enzyme immunoassay,FEIA)。2.均相荧光免疫测定法:荧光偏振免疫测定(flu
10、orescence polarization immunoassay,FPIA)底物标记荧光免疫测定(substrate-labeled fluorescent immunoassay,SLFIA)一、时间分辨荧光免疫测定 基本原理 技术类型 技术要点 方法评价和临床应用 (一)、基本原理时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物(如Eu 3+螯合物)标记抗体或抗原,检测标本中的相应抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命,利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间,可排除标本中非特异性荧光的干扰,所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。另一个特点是激发光与荧光的波长差别显著,其波长转变达270nm,
11、可有效排除激发光的干扰,测得的荧光为稀土元素螯合物发出的特异性荧光信号(图18-4)。(二)、技术类型1固相双位点夹心法 2固相抗原竞争法 3固相抗体竞争法 1固相双位点夹心法使用针对抗原不同决定簇的两种特异性抗体,一种包被在固相上,另一种用Eu3+标记。标准品或待测抗原先与固相抗体反应,洗涤后再加入Eu3+标记的抗体,再次温育,形成固相抗体-抗原- Eu3+标记抗体复合物,充分洗涤后加入增强液,测定荧光强度,所测得的荧光强度与待测抗原浓度成正比(图18-5)。 2固相抗原竞争法将大分子抗原直接(或小分子半抗原通过化学偶联法制成半抗原-蛋白质结合物)包被在固相上,成为固相抗原。待测抗原和固相抗
12、原竞争结合定量的Eu3+标记抗体,标本中待测抗原浓度越高,则Eu3+标记抗体结合到固相上的量越少,因此所测得的荧光强度与标本中待测抗原浓度成反比。3固相抗体竞争法待测标本中抗原和Eu3+标记的抗原与固相抗体(特异性抗体包被固相)发生竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度,所测得的荧光强度与待测抗原含量成反比。目前为了生产试剂盒的方便,常用抗抗体(Ab2)包被固相,这种固相抗抗体实际上是一种通用的分离剂,分离Eu3+标记抗原和Eu3+标记抗原抗体复合物。(三)、技术要点以固相双位点夹心法检测(alpha-fetoprotein、AFP)为例。以抗人AFP多克隆抗体包被聚苯乙烯
13、微量滴定条或珠,加入不同浓度的AFP标准品和待测血清,加入缓冲液反应46h。洗涤后,加入生物素化抗人AFP单克隆抗体,振荡温育反应46h。洗涤后,加入Eu3+标记的链霉亲和素,振荡反应1h。洗涤后,加入增强液,快速振荡15min,放置15min后在时间分辨荧光分析仪上测量,根据标准曲线计算得出待测血清中AFP浓度。(四)、方法评价和临床应用TR-FIA方法特异性强,灵敏度高(可达0.21ng/ml)。标准曲线范围宽 (跨越45个数量级)。分析速度快。标记物制备较简便、有效使用期长,无放射性污染。检测项目多:各种激素(肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等)、蛋白质、酶、药物、肿瘤标记物和病毒抗原等
14、。二、荧光偏振免疫测定基本原理技术要点方法评价和临床应用(一)、基本原理荧光偏振免疫测定是利用荧光素经偏振光照射而跃入激发态,在回复至基态后可释出光子,经偏振仪形成偏振荧光,荧光偏振强度与荧光分子的大小成正比的关系而建立的免疫分析技术。 FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。其原理:待测的小分子抗原和荧光素标记的小分子抗原(恒定量)与相应抗体(恒定量)竞争结合。当待测的小分子抗原浓度高时,经过竞争反应,大部分抗体被其结合。而荧光素标记的小分子抗原多呈游离状态,因其分子小,在液相中转动速度较快,测量到的荧光偏振强度也较低。反之,如待测的小分子抗原浓度低时,大部分荧光素标记的小分子抗原与抗体结合,
15、形成大分子的标记抗原抗体复合物,此时检测到的荧光偏振强度也较高,即荧光偏振强度与待测小分子抗原浓度呈反比(图18-6)。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关系建立标准曲线,可检测小分子抗原的浓度。(二)、技术要点 以环孢素测定为例。1标本的预处理 取待检全血,加入溶解剂和蛋白沉淀剂,混匀后离心,上清待用。2抗原抗体反应 在反应管中分别加入一定量的预处理标本上清、荧光素标记的环孢素、抗环孢素单克隆抗体及反应缓冲液进行抗原抗体反应。3偏振荧光强度测定 抗原抗体反应开始时,立即用荧光偏振免疫分析仪测定其空白偏振荧光强度(P1),反应结束时再测定其偏振荧光强度(P2),根据待测标本的偏振荧光强度P(P2-P1),从标准曲线上直接计算出所测物质的含量。(三)、方法评价和临床应用FPIA方法具有下述优点:均相测定方法简便,易于快速、自动化进行。荧光标记试剂稳定、有效期长,并使测定的标准化结果可靠。可用空白校正
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