HIV抗体检测试剂盒-工艺流程图

1、精选优质文档-倾情为你奉上精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业专心-专注-专业精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业 HIV（1+2型）抗体检测试剂盒(免疫印迹法)生产工艺流程1、HIV抗体检测试剂盒(免疫印迹法)工艺流程图 检验电泳胶配制 转膜 HIV膜条制备 HIV膜条分装 HIV反应膜条 检验强阳性对照配制 强阳性对照分装 检验弱阳性对照配制 弱阳性对照分装 质控品 检验阴性对照配制 阴性对照分装 浓缩样品稀释缓冲液10配制 浓缩样品稀释缓冲液10分装浓缩洗膜缓冲液10配制 浓缩洗膜缓冲液10分装 酶结合物 检验 酶结合物分装 显色试剂底物液 底物液分装封闭粉 封闭粉分装HIV

2、反应膜条质控品 试剂盒组装 成品入库显色试剂 成品检验孵育板2、各工艺的步骤和要求目录2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定2.1.1.2 2%琼脂糖封边2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.3.1 20ml 4%分离胶配制2.1.1.3.2 20ml 20%分离胶配制2.1.1.3.3 梯度分离胶灌胶 2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备2.1.2 蛋白电泳分离2.1.2.1 样品的制备2.1.2.2 上样2.1.2.3 电泳2.1.3 半干转膜2.1.3.1 准备滤纸和NC膜2.1.3.2 装备转移三明治2.1.3.3

3、 转膜2.1.4 封闭2.2 质控品2.2.1 强阳性对照的配制2.2.2 弱阳性对照的配制2.2.3 阴性对照的配制2.3 显色试剂的配制2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10的配制2.3.2 浓缩洗膜缓冲液 20的配制2.3.3 酶结合物的配制 2.3.4 底物液 2.3.5 封闭粉 2.3.6显色具体操作步骤2.3.6.1 试剂准备2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液2.3.6.1.2封闭缓冲液2.3.6.1.3酶结合物工作溶液2.3.6.1.4 底物液（已配制好）2.3.6.2 具体步骤2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定取洁净的透明玻璃板两块（一大

4、一小），将两个相同的透明塑料片放在小玻璃板的长边沿的两边，再将大玻璃板附上，用4个黑色夹子固定比例夹板（如图所示）,放入烘箱80预热7min左右。2.1.1.2 2%琼脂糖封边用电子天平取2g琼脂糖，于锥形瓶中，再加入1x电泳液100ml，用微波加热至完全溶解，用棉塞封好口，备用。将上述琼脂糖倒入适量至小烧杯中,待玻璃板加热还剩1min时,将小烧杯放入微波炉中加热至沸腾,连续沸腾2次。（注意：待琼脂糖液体刚沸腾冒气泡时，要及时按微波炉的暂停键，以免使液体溢出烧杯流到微波炉上。）待计时器响后，从烘箱中拿出玻璃板，再将小烧杯中的琼脂糖加热至沸腾1次，用注射器迅速吸取5ml熔化的琼脂糖沿玻璃夹板左边

5、注入2ml，待琼脂糖液体流至底部中间位置时，再沿夹板右边注入2ml，使两边的琼脂糖液流汇合在一起，底部有0.5至1cm左右的平整琼脂凝胶即可（此时因玻璃板是热的，所以会有凝胶漏出，保证胶有一定的高度即可，），静置10min，凝固。（注意：注入时应使注射器针头中的琼脂糖液流垂直流下，成一条直线，不可堆积且不可产生气泡。换边封胶时要注意不要不凝胶滴到玻璃内部。判断封边是否合格：底部凝胶是否能流成一条直线. 底部凝胶是否具有一定的厚度（0.5cm1cm）。如果上述标准没有达到，请再重新封边，以免影响后续实验。 ）2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.3.1 20ml 4%分

6、离胶配制 配方试剂体积（ml）水11.930%丙烯酰胺2.71.5M Tris-Hcl(PH8.8) 510% SDS0.210%过硫酸铵0.2TEMED0.012用移液枪（量程5ml）分别量取11.9ml水、2.7m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH8.8）于同一烧杯中，再用移液枪（量程200ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%过硫酸胺（AP）加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器混匀。（注：请低速搅拌，避免起泡）最后用移液枪（量程20ul）取12ul TEMED加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器搅拌数秒混匀。用镊子取出搅拌子。（注：最后加入TEMED，

7、以防凝胶快速凝固）2.1.1.3.2 20ml 20%分离胶配制 配方试剂体积（ml）水1.330%丙烯酰胺13.31.5M Tris-Hcl (PH8.8)510% SDS0.210%过硫酸铵0.2TEMED0.008用移液枪（量程5ml）分别量取1.3水、13.3m 30%丙烯酰胺和5ml 1.5M Tris-Hcl（PH=8.8）于同一烧杯中，再用移液枪（量程200ul）依次量取200ul 10%SDS和200ul 10%过硫酸胺（AP）加入烧杯中放入搅拌子，用搅拌器混匀。最后用移液枪（量程20ul）取8ul TEMED加入烧杯中，用搅拌器搅拌数秒混匀。2.1.1.3.3 梯度分离胶灌胶

8、 先将混合器开关关了，将配制好的 4%分离胶倒入梯度胶混合器A，将配制好的20%分离胶倒入梯度胶混合器B，梯度胶混合器B搅拌子继续搅拌，打开混合器开关，在蠕动泵上按开始键，将导管从玻璃夹板中间放入底部，并导管口随液面升高而升高（保持导管口在液面上方并接触液面），直到泵停止灌胶，用移液枪从玻璃夹板中间缓慢加入2ml乙醇（或水）。静置10min,待胶凝固。 注意：混合器的清洗：待灌完胶，往混合器里加入灌水，清洗导管，2-3次，按快速键将导管里的液体排干，将混合器倒过来，晾干，方便下次使用。 2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备 配方试剂体积（ml）水10.230%丙烯酰胺2.551M Tris

9、-Hcl (PH6.8)1.87510% SDS0.1510%过硫酸铵0.15TEMED0.015用移液枪（量程5ml）分别量取10.2水、2.55m 30%丙烯酰胺和1.875ml 1M Tris-Hcl（PH=6.8）于同一烧杯中，再用移液枪（量程200ul）依次量取150ul 10%SDS和150ul 10%过硫酸胺（AP）加入烧杯中。最后，用移液枪（量程20ul）取15ul TEMED加入烧杯中，放入搅拌子，用搅拌器搅拌数秒混匀。用一次性移液管（量程10ml）量取10ml 5%积层胶混匀夜，从中央灌满，插入梳子。静置30min，凝固。注：凝胶不能有气泡。如不马上用，请用保鲜膜包裹，加适

10、量缓冲液，4保存。 Ps:为实验方便，4%、20%分离胶和5%积层胶可以一起配制，但是未正式用前，请不要加入TEMED.2.1.2 蛋白电泳分离2.1.2.1 样品的制备将样品和5x Loading buffer按照体积比为4:1的比例混合560ul，煮沸5min，13000rpm/min离心2min。2.1.2.2 上样将玻璃夹板（短玻璃内侧）用黑色夹子固定在电泳仪上，另一边也固定一块洁净的大玻璃板，用1x电泳液灌满电泳仪上面的水槽至液面高于短玻璃板2.5cm，检查不漏液，再灌下面水槽至超过玻璃板底部1cm以上即可，缓慢取出梳子。用移液枪取5ul 的marker点到两边的小上样孔，用移液枪将

11、560ul的蛋白样品点到中间的大上样孔。2.1.2.3 电泳将电泳盖盖上，正极接正极，负极接负极，设置参数：电压120V，电流：99mA，时间：300min，恒压电泳开始。（注：电泳正常启动时，电极丝会有大量小气泡往上升，若没有，请检查电源是否插好。）2.1.3 半干转膜2.1.3.1 准备滤纸和NC膜 依据胶的大小剪好NC膜(高*宽：11.5-12cm*17cm)和16张滤纸（高*宽：11-11.5cm*16.5cm）；2.1.3.2 装备转移三明治 装配转移三明治( eq oac(,-)8层滤纸胶膜8层滤纸 eq oac(,+)：将电转液加入搪瓷盘，在最底层加入8层滤纸，赶走气泡；然后用镊

12、子将玻璃板撬开，除去小玻璃板后，用塑料刀将积层胶和凝胶切下轻轻刮去，避免把分离胶刮破。小心剥下地把分离胶覆盖于滤纸上，调整使其与滤纸对齐，轻轻用塑料刀擀去气泡；接着再将NC膜铺在上面，赶走气泡；最后再将8层滤纸覆盖上。（PS：必要时可倒些电转液将胶湿润，使其更好地移出。NC膜要注意正反面做好标记，粗糙的一面对着胶）2.1.3.3 转膜 将装配好的三明治结构转至转膜仪，加入适量的转移缓冲液，设置参数，电压30V，电流495mA，时间：50min，恒流转膜开始；（注：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。）2.1.4 封闭 转膜结束后，切断电源，取出膜。 用5%的封闭液将膜封闭，37

13、2h 或 4过夜。 2.2 质控品2.2.1 强阳性对照的配制 灭活的高滴度人血清2.2.2 弱阳性对照的配制 灭活的低滴度人血清2.2.3 阴性对照的配制 灭活的正常人血清2.3 显色试剂的配制2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10的配制 名称KH2PO40.27gNa2HPO41.42gNaCl8gKCl0.2g纯水800ml2.3.2 浓缩洗膜缓冲液 10的配制 名称1M Tris-HCl(pH7.4)40mlNaCl17.532gTween201ml纯水定容至200ml2.3.3 酶结合物的配制 可用 碱性磷酸酶山羊抗人IgG 酶结合物2.3.4 底物液 可用 BCIP/NBT底物液 底物

14、液2.3.5 封闭粉 可用 脱脂奶粉 封闭粉2.3.6显色具体操作步骤2.3.6.1 试剂准备2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液a.每次使用前新鲜配制洗膜缓冲液。b.将1体积的浓缩洗膜缓冲液（20*TBST：20，现用是10）加入到19体积的蒸馏水中，充分混匀。2.3.6.1.2封闭缓冲液a.每次使用前新鲜配制封闭缓冲液。b.将1体积的浓缩样品稀释缓冲液加入到9体积的蒸馏水中，充分混匀。c.在上步骤（2.b）中配制的稀释后的浓缩样品稀释缓冲液中，每20ml加入0.1gMP: 1g封闭粉，充分混匀，溶解。 2.3.6.1.3酶结合物工作溶液a.用上述配好的封闭缓冲液按1:500MP：1:1000比

15、例稀释酶结合物。例如：每4L酶结合物加入2ml封闭缓冲液。酶结合物工作液必须在使用前配制。（AutoBlot用户，则须在不超过1.5小时前配置。）2.3.6.1.4 底物液（已配制好）a可以直接使用。请用洁净吸管直接从容器中吸取需要的液体，用后拧紧盖子。2.3.6.2 具体步骤步骤内容6.2.2.1每槽内加入2ml的稀释洗试剂膜缓冲液。2ml6.2.2.2用镊子小心取出需要的试剂膜条，有号码的一端向上，分别放入孵育板槽内。包括一条强阳性对照、一条弱阳性对照和一条阴性对照。-6.2.2.3在室温下（22-28）将孵育板置摇床（每分钟摇摆12至16次）上振荡孵育10分钟。用吸引器吸出缓冲液。再重复步骤6.2.2.1两次.25310分钟6.2.2.4在每槽中加入2ml上述配好封闭缓冲液，随后分别加入20ul病人血清或强阳性，弱阳性，阴性对照。2ml封闭缓冲液20ul强阳性6.2.2.5盖好孵育板，于室温下（22-28）在摇床上震荡孵育2小时。2532小时6.2.2.6小心掀开孵育板盖以避免溅出，用吸引器吸出反应液。不同的样品间需换吸头以避免交叉污染。6.2.2.7每槽中加入2ml的洗膜缓冲液，置摇床上振荡5分钟，弃洗液，再重复两次。32ml6.2.2.8每槽中加入2ml的酶结合物工作溶液。盖好孵育版，于室温下（22-28）在摇床上振荡孵育2小