6蛋白质离子交换层析,蛋白质紫外

1、实验六 蛋白质技术离子交换层析浓缩蛋白质溶液紫外分光光度法测定蛋白质浓度离子交换层析浓缩蛋白质溶液基本概念 层析法是一种基于被分离物质理化和生物学特性的不同（吸附力、分子量、电荷性质、溶解度、亲和力），使其在某种介质中移动的速度不同而进行分离和分析的方法。溶有叶绿素的乙醚碳酸钙粉末黄色的色带（叶黄素）绿色的色带（-胡萝卜素）继续洗脱，分段收集，就可以使叶黄素和-胡萝卜素分离一个 经典的层析实验叶绿素的层析分离色谱法基本概念固定相是层析的一个基质固体（吸附剂、凝胶、离子交换剂）液体（固定在硅胶或纤维素上的溶液）能与待分离物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用阻力：阻止所分离的样品向前移动流动相推动固

2、定相上待分离的物质朝一个方向移动的液体、气体或超临界体等。洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。动力：不断地前移，并带动所分离的样品向前移动分配系数（K）在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值被分离物质本身的性质、固定相和流动相的性质、层析柱的温度洗脱用洗脱液冲洗层析柱，使样品中不同组分得以分离的过程。洗脱曲线以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线。(二)层析法分类1.根据分离原理： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。2.根据流动相不同：液相层析（液-液层析，液-固层析）、气相层析（气-液层析，气-固层析）3.根据支持物方式：柱层析、纸层析、薄层层析、高

3、效液相层析离子交换层析根据物质的带电性质不同而进行分离固定相：离子交换剂人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶离子交换层析柱常用的阳离子交换纤维素（本身阴离子）有: 磺酸甲基纤维素(SMC) 羧甲基纤维素(CMC) 磷酸基纤维素(PC)常用的阴离子交换纤维素（本身阳离子）有: 二乙基胺乙基纤维素(DEAEC) 三乙基胺乙基纤维素(TEAEC)离子交换层析基本原理123451. 平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2. 吸附阶段：样品与反离子进行交换3、 解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质4. 再生阶段：用原始平衡液进行充分

4、洗涤，既可重复使用平衡液的反离子样品溶液洗脱液（梯度浓度） 蛋白质的等电点一般低于8，在pH为8的弱离子强度溶液带负电荷，可以被阴离子交换树脂吸附。当增加缓冲液离子强度或阴离子电负性时，可以将蛋白质成批量洗脱下来，达到蛋白质浓缩的目的。试剂:待浓缩样品：低浓度蛋白质溶液阴离子交换树脂纤维素DE-52（DEAE Cellulose DE-52 ） 预溶胀微粒, 为中等碱性阴离子交换剂 上样缓冲液低离子强度缓冲液： 0.02 M 磷酸缓冲液 - 0.02 M NaCl （ pH8.0）洗脱缓冲液高离子强度缓冲液： 0.02 M 磷酸缓冲液 - 1 M NaCl （ pH8.0） 实验操作及注意事项

5、 预装层析柱（注意：不要干柱） 柱的平衡 用10ml的上样缓冲液过柱 浓缩前蛋白质浓度的测定 取待浓缩的蛋白质溶液在分光光度计上测定蛋白质的OD280 和OD260值 上样 加入低浓度蛋白质溶液（保护胶面,让样品全部进入树脂中。 平衡（洗杂质） 用20ml的上样缓冲液流过柱子。 洗脱 用20ml洗脱缓冲液过柱，回收蛋白。（收集4管，每管3ml） 测定蛋白浓度 在收集的过程中测定每管溶液的OD280和OD260读数，选取浓度最高管为浓缩蛋白计算浓缩倍数蛋白质含量的测定 紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理原理：酪氨酸、色氨酸的苯环共轭双键，OD280优点：简单、快速、样品可以回收缺点：有一定的误差（酪氨酸、色氨酸含量差异）受核酸类物质干扰注意： 在紫外光下检测，使用石英杯实验操作与结果分析 在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。 OD值大于1的稀释5倍再测 1、OD280OD2601.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mgm1) 1.5OD2800.75OD2602、OD280OD2601.5时，用Lamb