考点加强课5-基因表达载体构建中限制酶的选择原则ppt

1、限度 酶抉择 的三大年夜 依照1.依照目标 基因两头 的 限度 酶切点断定 限度 酶的种类(1)应抉择 切点位于目标 基因两头 的 限度 酶，以便将目标 基因“切出，如图甲可抉择 Pst (目标 基因两头 均具Pst )。(2)不克不及 抉择 切点位于目标 基因外部的限度 酶，以防破坏目标 基因，如图甲不克不及 抉择 Sma。(2)为避免目标 基因跟 质粒的自身环化跟 随便 连接 ，也可应用 差别 的限度 酶切割目标 基因跟 质粒，如图甲也可抉择 用Pst跟 EcoR两种限度 酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，并且 这种切点不至于完整 破坏“标记 基因。2.依照质粒的特色 断定 限度 酶

2、的种类(1)所选限度 酶要与切割目标 基因的限度 酶相不合 ，以确保存在 一样的黏性最后 。(2)质粒作为载体必须 存在 标记 基因等，因而 所抉择 的限度 酶只管 不要破坏这些结构，应至少含有一个完整的标记 基因，如图2中限度 酶pst因其会破坏该质粒上唯一 的标记 基因而不宜抉择 。(3)所选限度 酶切点不该 位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中Kpn)。假如所选酶的切点不止一个，那么切割重组后能够会丧掉 某些片段 假设 丧掉 的片段 含复制终点区，那么切割重组后的片段 进入受体细胞后不克不及 自立 复制。(4)所选限度 酶，其切点应位于启动子与停止 子之间，如图2中Hind会破坏启动

3、子，EcoR会破坏停止 子，而Nde 跟 BamH切出的瘦语 可让目标 基因嵌入启动子与停止 子之间。3.参照Ti质粒的TDNA片段 抉择 限度 酶 假设 质粒上标出TDNA片段 ，那么所选限度 酶切点应位于TDNA片段 中，从而有利于将目标 基因嵌入到TDNA片段 上因为 Ti质粒的TDNA片段 最易转移至受体细胞同时整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现 “转化。如用两种限度 酶Xba跟 Sac(两种酶切出的黏性最后 差别 )切割某DNA，取得含目标 基因的片段 。假设 应用该片段 构建基因表白 载体，那么甲丁四种Ti质粒中宜抉择 “丙作载体，而不宜抉择 甲、乙、丁。(剖析如下)1.(20

4、16世界 卷，40)图(a)中的三个DNA片段 上依次表示 出了EcoR、BamH跟 Sau3A三种限度 性内切酶的识不序列与切割位点，图(b)为某种表白 载体的表示 图(载体上的EcoR、Sau3A的切点是唯一 的)。依照基因工程的有关常识 ，回答以下咨询 题：(1)经BamH酶切后掉 掉 落 的目标 基因能够 与上述表白 载体被酶切后的产品 连接 ，来由 是_。(2)假设 某人 应用图(b)所示的表白 载体取得了甲、乙、丙三种含有目标 基因的重组DNA分子，如图(c)所示，这三种重组DNA分子中，不克不及 在宿主细胞中表白 目标 基因产品 的有，不克不及 表白 的缘故是_。(3)DNA连接

5、 酶是将两个DNA片段 连接 起来的酶，罕见的有跟 ，其中 既能连接 黏性最后 又能连接 平最后 的 是_。慧眼识图猎取 信息(1)三种限度 酶切割结果剖析(2)基因表白 载体剖析答案 (1)Sau3A两种酶切割后发生的片段 存在 一样的黏性最后 (2)甲、丙甲中目标 基因拔出在启动子的卑鄙 ，丙中目标 基因拔出在停止 子的卑鄙 ，二者的目标 基因均不克不及 被转录(3)EcoliDNA连接 酶T4DNA连接 酶T4DNA连接 酶2.(2016经典高考)下表是多少 种限度 酶识不序列及其切割位点，图1、图2中标注了相干 限度 酶的酶切位点，其中 切割位点一样的酶不重复标注。请回答以下咨询 题：

6、(1)用图中质粒跟 目标 基因构建重组质粒，应选用两种限度 酶切割，酶切后的载体跟 目标 基因片段 ，经过酶感化 后取得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于态的大年夜 肠杆菌。(2)为了抉择 出转入了重组质粒的大年夜 肠杆菌，应在抉择 平板培养 基中增加 ，平板上长出的菌落，常用PCR判定 ，所用的引物构成 为图2中。(3)假设 BamH酶切的DNA最后 与Bcl酶切的DNA最后 连接 ，连接 部位的6个碱基对序列为，对于 该部位，这两种酶(填“都能、“都不克不及 或“只要一种能)切开。(4)假设 用Sau3A切图1质粒最多能够取得种大小 差别 的DNA片段 。审题指导 第一步：起首 看

7、目标 基因两侧有何种切割位点以保障 能将目标 基因“切出如图2应用 BamH、Bcl可堵截 左侧，Hind、Sau3A可堵截 右侧第二步：再回到“质粒，看质粒中限度 酶切割位点，如图中总共 有BamH、Bcl、BamH及Hind四个限度 酶识不位点，其中 并不存在目标 基因中Sau3A 酶识不位点，故不选Sau3A 酶，而BamH在四环素抗性基因与氨苄青霉素抗性基因中均存在，倘假设 应用 该酶将会导致 两个标记 基因同时被破坏，故只能抉择 Bcl与Hind，而应用 此两类酶将导致 氨苄青霉素抗性基因遭破坏，因而制备重组质粒抉择 培养 基时只能依照“四环素抗性基因，如以下图所示：其余 ，依照Ba

8、mH跟 Bcl的酶切位点，BamH酶切的DNA最后 与Bcl酶切的DNA最后 连接 ，连接 部位的6个碱基对序列为 ，这与两种酶的酶切位点均差别 ，即两种酶在该片段 寻 不到识不位点。又依照BamH、Bcl跟 Sau3A的酶切位点，Sau3A在质粒上有三个酶切位点，完整 酶切可掉 掉 落 记为A、B、C三种片段 ，假设 部分位点被切开，可掉 掉 落 AB、AC、BC、ABC四种片段 ，因而 用Sau3A切图1质粒最多能够取得7种大小 差别 的DNA片段 。答案 (1)Bcl跟 HindDNA连接 感触 (2)四环素引物甲跟 引物丙3都不克不及 (4)71.(2019河南华夏 名校联考)人类是乙

9、型肝炎病毒的唯一 宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝开展 而来，接种乙肝疫苗是防备 乙肝病毒感染 的最有效办法。乙型肝炎疫苗的研制先后经历 了血源性疫苗跟 基因工程疫苗阶段。血源性“乙型肝炎疫苗是取用乙肝病毒感染 者的血液，用差速离心提纯血液中的乙肝病毒，之后再灭活，制成乙肝疫苗。基因工程乙肝疫苗的花费 跟 应用 过程 如图1，图2表示 大年夜 肠杆菌质粒的相干 基因与限度 酶切点；图3表示 有关限度 酶在DNA分子中的具体 切点。请回答相干 咨询 题：(1)从图1可知，该目标 基因的具体 功能 是_。(2)抉择 大年夜 肠杆菌质粒作为运载体的缘故是_。(3)用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全

10、，试从疫苗的结构特色 说明 缘故：_。(4)形成 有效的重组质粒，抉择 恰当 的限度 性内切酶非常主要 。某进修 小组依照图2跟 图3提出了三种计划 ：独自应用 BamH 、分不该 用 BamH 跟 EcoR 以及分不该 用 Hind跟 EcoR ，且认为 抉择 应用 BamH跟 EcoR最准确 。该计划 的长处 是_。假如抉择 应用 Hind 跟 EcoR ，那么在构建重组质粒后，还需要 应用 技巧 以检测目标 基因是否 导入受体细胞。答案 (1)指导 剖析 乙肝病毒外壳(2)对受体细胞有害；具标记 基因，能对重组DNA是否 进入受体细胞停顿判定 ；在宿主细胞内能自我复制；存在 多个酶切位点

11、，供外源基因拔出其中 。(3)血源性疫苗需灭活破坏其核酸结构，灭活不堪 利 那么会导致 接种者患乙肝，而基因工程疫苗仅有乙肝病毒外壳，不需要 灭活(4)既避免了质粒发生 自身环化跟 目标 基因与质粒之间的反向连接 ，又便于抉择 出含有目标 基因(重组质粒)的受体细胞DNA分子杂交(或核酸分子杂交、分子杂交)2.(2019山东湖北部分重点中学联考)如下图为培养 二倍体转基因抗虫玉米的两种思路 。EcoR 、Sma 、BamH 为限度 酶(箭头所指为酶切位点)。回答以下咨询 题：(1)据图，猎取 目标 基因时不克不及 抉择 Sma酶的缘故是它_。抉择 EcoR 跟 BamH酶的长处 是可避免目标

12、基因与质粒连接 。(2)与思路 1比拟 ，思路 2的最大年夜 长处 是取得的转基因抗虫玉米。(3)培养 转基因抗虫玉米的核心 步调 是_。其目标 是使目标 基因在受体细胞中_。(4)将重组质粒导入受精卵，采用最多的办法是农杆菌转化法，这跟农杆菌的有关。(5)操纵 常用的办法是_。剖析 (1)题图表现 ：目标 基因中存在Sma 的识不位点。假设 应用 Sma 切割外源DNA，那么会破坏外源DNA中的目标 基因的结构，因而猎取 目标 基因时不克不及 抉择 Sma 切割。EcoR 跟 BamH 的识不位点差别 ，形成 的黏性最后 差别 ，因而抉择 EcoR 跟 BamH 切割质粒跟 外源DNA，其长

13、处 是可避免目标 基因与质粒反向连接 。(2)思路 1是将重组质粒导入玉米的受精卵中，由该受精卵发育成的植株不必定 基本上 纯合子，思路 2是将重组质粒导入由花粉经过脱分化形成 的愈伤构造 中，由该愈伤构造 形成 的单倍体幼苗2再经过人工引诱 ，使其染色体更加 ，终极 掉 掉 落 的玉米株基本上 纯合子。可见，与思路 1比拟 ，思路 2的最大年夜 长处 是取得的转基因抗虫玉米基本上 纯合子(或答不发生 性状不离)。(3)培养 转基因抗虫玉米采用的是基因工程技巧 ，该技巧 的核心 步调 是基因表白 载体的构建。构建基因表白 载体的目标 是：使目标 基因在受体细胞中动摇存在并可遗传给下一代，同时使目标 基因能够 表白 跟 发挥 感化 。(4)农杆菌的Ti质粒上存在 TDNA，TDNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的