基因诊断与测序技术在其中的应用-陈然-2015-03-20

1、基因诊断与测序技术在其中的应用武汉分子生物学实验室 陈然2015-03-20内容基因诊断的概念基因测序技术及发展沿革一代测序及片段分析检测流程二代测序技术流程测序结果的分类及测序策略的选择测序技术的局限性基因诊断的概念内容-1基因诊断基因预测基因检测基因预测基因诊断即分子诊断，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化等而做出的或辅助临床诊断的技术。又称基因体检，通过检测基因判断未来患某种疾病的可能性（风险预测），进而加强健康管理。基因诊断基因治疗基因诊断的概念正常人不会发生融合基因或基因突变。某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。融合基因两个或多个基因的编码区相连接，表

2、达融合蛋白。可由染色体易位造成，常与染色体项目、流式项目同时送检。项目：BCR/ABL, AML1/ETO, PML/RARa, AML 16种筛查，ALL 15种筛查，31种筛查技术：定性PCR、定量PCR、基因芯片、二代测序。基因突变基因在结构上发生的碱基对或排列顺序的改变，包括点突变、插入/缺失突变（INDEL）。项目：JAK2 V617F, CALR Exon9, AML预后, EGFR, Kras, HLH, Fanconi, 地贫DMD, HBV耐药技术：定量PCR、基因芯片、一代测序、二代测序、MLPA、定性PCR、杂交。分子实验室开展的诊断类检测-1正常人和某些疾病的患者间基因

3、表达量不同。基因分型用分子生物学手段检测个体基因型（Genotype）。项目：配型, 嵌合率, HCV分型，SNP，亲子鉴定技术：一代测序、片段分析、二代测序、基因芯片。基因表达量化检测mRNA的多少。项目：化疗ERCC1，RRM1，TUBB3，TYMS基因mRNA表达含量技术：定量PCR、二代测序。正常人之间的基因分型不同。分子实验室开展的诊断类检测-2基因测序技术及发展沿革内容-2DNA测序技术，即基因测序技术，是指测定DNA碱基序列的技术。人类基因组约有30亿个碱基对。大部分DNA测序的目的是得到特定基因的特定区域上序列信息A、T、G、C四种碱基的排列顺序，即靶向基因测序/目标区域测序。

4、通过对比被检者的碱基排列顺序是否与正常人一致，以此作为疾病诊断的依据。测序技术已广泛应用在医学、生物学研究，各类疾病的检测和筛查，物种鉴定，农作物筛选，基因工程基因测序技术为什么使用测序技术进行诊断既能检测已知突变、也能检测未知突变。二代测序技术的发展使得基因诊断的深度和广度得到极大扩展，使得多基因参与的复杂疾病检测，及高灵敏度检测成为可能。能够检测一段区域内的所有点突变。具备成本和可操作性上的优势。Thermo Life/ABI3500 xLBeckman CoulterGenomeLab GeXPRoche/454Genome Sequenser FLXIllunima HiSeq 250

5、0Life/Ion TorrentPGMPacBio RS System一代测序二代测序三代测序1977起2005起2011起Thermo Life/ABISolid 5500测序技术的发展一代测序二代测序(NGS)三代测序(3GS)技术原理双脱氧末端终止法（Sanger法）+毛细管电泳（CE）；Roche 454：高通量焦磷酸测序；Illumina：桥接PCR+边合成边测序；ABI Solid：寡聚物连接检测测序；Ion Torrent：H+电位信号检测+半导体芯片；大规模平行测序（massively parallel DNA sequencing），生物信息技术处理产出数据；单分子实时测序

6、；特点高读长；检测通量中等；检测灵敏度低；单孔成本低，适用于少数基因的少量位点测序；检测通量高；检测灵敏度高；开机运行成本高，但平摊到每样本、每碱基的成本低；适用于多基因，多位点的测序；可自动完成数据分析；高读长，特别适合于de novo测序；检测通量高；准确性低（81-83%）；开机运行成本很高；应用范围研究和临床检测；研究和临床检测；目前只用于研究；三代测序技术的比较一代测序及片段分析检测流程内容-3样本收取&处理PCR扩增目的片段酶解消化测序反应（双脱氧末端终止法）测序反应产物纯化（乙醇沉淀）加入Hi-Di甲酰胺，变性基因分析仪上机（毛细管电泳）分析结果，得出报告一代测序检测流程医院前处

7、理录入Lis系统分子实验室分拣、登记物流标本（血液）DNARNA提取核酸过程标本收取&处理PCR：Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应）的简称。PCR是一个在体外特异性的复制一段DNA片段的过程。1985年由美国科学家Mullis发明。分子生物学最常用的体外扩增DNA的方法，使人们很快的获得大量拷贝的特异DNA片段，利于继续进行后续检测的分析。DNA模板；4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP ）；耐热性聚合酶(如Taq)；一对特异性引物；适量的反应缓冲液；基因扩增仪（PCR仪）PCR扩展目的基因片段时间温度延伸3变性1退火21

8、个PCR循环包括变性、退火、延伸3步重复13步30-35轮目的DNA片段扩增百万至亿倍以上，能够被电泳等后续方法检测到。DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR程序模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点56引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72引物1引物2DNA引物TaqTaqdATPdGTPdTTPdCTPPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95第1轮循环结束第2轮循环开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaqdATPdGTPdTTPdCTP56

9、7295PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮循环结束第3轮、第4轮No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824经多次循环后靶片段扩增的数量SAP：Shrimp Alkaline Phosphatase，虾碱性磷酸酶，催化降解体系里多余的dNTP。Exo I： Exonuclease I，核酸外切酶I，催化分解体系里多余的单链DNA（即引物）。同时向PCR产物中加入一定的SAP和Exo I，去除多余的dNTP和引物，只保留扩增产物，达到纯化的效果。酶解

10、消化Frederick Sanger, 1918-2013。1958年和1980年诺贝尔化学奖得主。1977年提出双脱氧末端终止法。在反应体系中加入已经过酶解消化的PCR产物、耐热性聚合酶、4种脱氧单核苷酸dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、4种带荧光标记的双脱氧单核苷酸ddNTP（包括 ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP ）、单条特异性引物、适量的缓冲液。测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）# 由于双脱氧单核苷酸缺乏延伸所需要的3-OH基团，一旦掺入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。# 每当DNA聚合酶需要dNTP参入到正常延长的DNA链中时，

11、就有两种可能性，一是掺入ddNTP，结果导致DNA链延长的终止；二是掺入dNTP，使DNA链仍可继续延长，直至掺入下一个ddNTP。# 根据这一方法，就可得到一组长短不一的链终止产物，彼此只相差一个碱基。它们有共同的起始点，但终止在不同的荧光标记的ddNTP上。# 通过高分辨电泳对这一组产物进行分离，光学系统捕捉到ddNTP的荧光信号，以峰的形式展现成图谱，并按顺序排列。从电泳图谱上可读得DNA碱基序列。测序反应：双脱氧末端终止法（Sanger法）-2测序反应产物纯化目的：去除多余荧光ddNTP对激光检测器的干扰；方法：乙醇沉淀法。加入Hi-Di甲酰胺并变性：将DNA双链打开，维持其处于单链状

12、态。测序反应产物纯化及变性基因分析仪工作原理基因分析仪是进行毛细管电泳的仪器，而不是测序反应发生的场所。毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）：以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳的分辨率比PAGE电泳更高，能够分辨出1个碱基的DNA片段差异。经双脱氧末端终止法扩增出来的以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段通过毛细管电泳分离，再经激光系统对ddNTP上的荧光信号检测，就能得到DNA的序列信息。基因分析仪上机参考序列样本序列报出与参考序列不一致的地方测序结果分析毛细管电泳

13、分离Sanger法测序产物 一代测序分离PCR产物 片段分析片段分析（Fragment Analysis）：用带荧光标记的引物扩增目的DNA片段（可实现多重扩增），产物经毛细管电泳分离后得到荧光峰图谱，再经软件处理得出产物的片段大小，从而得到基因型等结果。基因分析仪不仅仅用于测序测序：检测DNA片段中的碱基序列。片段分析：分离荧光标记的片段并检测其大小。流程短；灵敏度高；多重扩增增加了检测通量；应用及衍生技术多；不能检测点突变，不能检测未知突变。测序vs片段分析片段分析SNP分型SNaPshotSNaPlex微卫星/STR基因连锁定位动物育种人身份鉴定微卫星不稳定性嵌合体相对荧光定量MLPAL

14、OHQF-PCR/QMPSF指纹图谱分析AFLP片段分析的应用样本收取&处理PCR扩增目的片段上样准备基因分析仪上机（毛细管电泳）分析结果，得出报告片段分析的检测流程PCR：引物带有荧光标记，故扩增出的PCR产物也带有荧光标记。上样准备：PCR产物+Hi-Di甲酰胺+内标，变性。基因分析仪上机：进行毛细管电泳，光学系统捕捉到荧光信号，并以峰的形式展现成图谱。PCR上样准备上机片段结果示例MLPA： Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification（多重连接依赖式探针扩增）的简称，由MRC-Holland公司于2002年首创。该技术利用杂交、连接和

15、PCR扩增反应三个基本步骤，在单个反应管内可进行最高达50种的核苷酸片段相对定量检测。优势：通量高；灵敏度高；操作简单；特别适于检测DNA缺失/重复突变（Indel），CNV（Copy Number Variation）突变。局限：不能用于检测STR（短串联重复序列多态性）；不能用于检测染色体平衡易位；不能用于单个细胞检测；开发新MLPA试剂盒很困难；只集中于人DNA分析；定量PCR不能达到Southern Blot费时费力测序不能检测中大片段Indel和CNVMLPA技术MLPA技术流程缺失突变CNV突变MLPA举例MLPA的量化结果ThermoFisher Scientific Life

16、TechnologiesIon Torrent二代测序平台内容-4.1Ion Torrent公司简介Ion Torrent公司，由Dr.Jonathan Rothberg创办。创立454生命科学公司，推出第一台NGS测序仪。2007年以1.4亿美元被罗氏公司收购。创立Ion Torrent公司，推出第一台半导体测序仪PGM。2010年以3.5亿美元被Life Technologies收购。创立RainDance公司，开拓出第三代PCR数字PCR技术。Ion Torrent半导体测序技术的特点-1成本低：设备价格实惠，无光学系统。通量灵活：选择合适的芯片，无论样本多少都能开机。小型化：为临床检测

17、而设计的台式测序仪，改变了NGS的发展方向。快速性：无荧光检测，测序步骤耗时短。Ion PGM首款半导体测序仪，全球销售速度、普及速度最快的测序仪。Ion Torrent半导体测序技术的原理Ion Torrent半导体测序核心技术Ion Torrent技术流程文库制备手工完成模板制备手工完成上机测序自动化完成数据分析自动化完成核酸提取PCR扩增目的片段文库制备的目的打断DNA分子增加接头增加Barcode模板制备的目的使ISP珠子上富集同一克隆的DNA片段。芯片上样和测序仪测序 PGM的清洗 PGM的初始化 模板上芯片ISP 珠子的Loading PGM测序结果数据分析通过专用服务器的插件分析

18、。插件平台开放，便于升级、共享。VariantCaller插件分析结果Illumina二代测序平台内容-4.2Illumina 公司，成立于1998年，原专注于BeadArray芯片分型技术。2006年收购Solexa，不断改良Genome Analyzer NGS平台，目前成为高通量测序的行业领导者。Illumina公司简介Illumina二代测序技术特点准确性高：唯一在Q30上表现出色的二代测序平台。世界上第一台获得FDA认证的测序平台。数据产出量巨大：大规模样本一起测序时，每样本平摊成本低。市场占有率高：众多科研文章均是基于Illumina平台发表。集成自动化：Miseq可承担簇生成、测

19、序与数据分析。Illumina二代测序核心技术Sequencing By Synthesis (SBS, 边合成边测序 )杂交的测序引物第一个碱基被合成，检测荧光信号切掉阻遏基团和荧光基团Illumina二代测序技术流程-1Illumina二代测序技术流程-2文库构建：通过捕获/扩增的方式达到：打断DNA分子、加接头、加Index。簇生成：经过桥接PCR在Flow Cell上生成大量模板。测序：每次流过1种dNTP；照相机拍下荧光信号；分析处理后得出碱基序列。决定了测序通量Illumina二代测序技术流程-3Library Preparation1Cluster Generation2MiSe

20、qcBotSequencing3MiSeqHiSeqData Analysis4MSRCASAVA手工完成自动完成自动完成自动完成MiSeqTruSight系列（肿瘤、心血管、遗传性疾病等）临床靶向基因测序（基因突变引起的疾病检测等），如范可尼贫血、MDS套系等。微生物基因组测序HiSeq 2500全外显子组测序转录组测序其他科研测序项目Illumina二代测序平台的分工Vcf.out数据结果测序结果的分类测序策略的选择内容-5测序结果报告&注释-致病性突变测序结果报告&注释-可能致病性/增加风险测序结果报告&注释-临床意义不明确测序结果报告&注释-多态性位点，无致病性已推出的遗传病测序检测项

21、目-1遗传代谢类疾病高苯丙氨酸血症甲基丙二酸血症糖原累积症戈谢病（注意与质谱的区别）遗传型肌肉病假肥大型肌营养不良症MLPA方法和测序方法是两个不同项目脊髓性肌萎缩运动、神经、生长发育异常软骨发育不全/低下脆性X综合征X连锁低血磷酸抗生素D佝偻病Rett综合症线粒体疾病线粒体脑肌病MELAS综合症MERRF综合症Leigh综合症已推出的遗传病测序检测项目-2儿科血液病嗜血细胞综合征范可尼贫血先天性纯合细胞再障地中海贫血血友病遗传性结缔组织疾病新生儿马凡氏综合症-FBN1基因测序Loeys-Dietz综合征-TGFBR1、TGFBR2基因测序遗传性心血管疾病载脂蛋白E基因分型家族性高胆固醇血症LDLR基因检测遗传性出血性毛细血管扩张症的基因检测遗传性淀粉样变性转甲状腺素蛋白TTR基因测序