DNA重组技术的基本工具

1、PAGE 用心 爱心 专心 116号编辑第1节 DNA重组技术的基本工具【本节重难点】重点：DNA重组技术所需的三种基本工具的作用难点：基因因工程载载体所需需要具备备的条件件【知识精讲讲】教材梳理知识点一 基因因工程的的概念：基因工工程是指指按照人人们的愿愿望，进进行严格格的设计计，并通通过体外外DNAA重组和和转基因因等技术术，赋予予生物以以新的遗遗传特性性，从而而创造出出更符合合人们需需要的新新的生物物类型和和生物产产品。由由于基因因工程是是在DNNA分子子水平上上进行设设计和施施工的，因因此又叫叫做DNNA重组组技术。注意：对本本概念应应从以下下几个方方面理解解：操作环境生物体外操作对象

2、基因操作水平DNA分子子水平基本过程剪切拼接接导入表达结果人类需要的的基因产产物知识点二 基因因工程的的基本工工具1.限制性性核酸内内切酶“分分子手术术刀”（1）限制制性内切切酶的来来源：主主要是从从原核生生物中分分离纯化化来的。（2）限制制性内切切酶的功功能：能能够识别别双链DDNA分分子的某某种特定定的核苷苷酸序列列，并能能将每一一条链上上特定部部位的两两个核苷苷酸之间间的磷酸酸二酯键键切开。（3）限制制性内切切酶的切切割方式式：在中心心轴线两两侧将DDNA切切开，切切口是黏黏性末端端。沿着中中心轴线线切开DDNA，切切口是平平末端。注意：比较较有关的的DNAA酶（1）DNNA水解解酶：能

3、能够将DDNA水水解成四四种脱氧氧核苷酸酸，彻底底水解成成膦酸、脱脱氧核糖糖和含氮氮碱基 （2）DNNA解旋旋酶：能能够将DDNA或或DNAA的某一一段解成成两条长长链，作作用的部部位是碱碱基和碱碱基之间间的氢键键。注意意：使DDNA解解成两条条长链的的方法除除用解旋旋酶以外外，在适适当的高高温（如如94）、重重金属盐盐的作用用下，也也可使DDNA解解旋。 （3）DNNA聚合合酶：能能将单个个的核苷苷酸通过过磷酸二二酯键连连接成DDNA长长链。 （4）DNNA连接接酶：是是通过磷磷酸二酯酯键连接接双链DDNA的的缺口。注注意比较较DNAA聚合酶酶和DNNA连接接酶的异异同点。2.DNAA连接酶

4、酶“分分子缝合合针”（1）DNNA连接接酶的分分类：EE.cooliDDNA连连接酶和和T4DNAA连接酶酶。（2）作用用及作用用部位：E.ccoliiDNAA连接酶酶作用于于黏性末末端被切切开的磷磷酸二酯酯键，TT4DNAA连接酶酶作用于于黏性末末端和平平末端被被切开的的磷酸二二酯键。3.基因进进入受体体细胞的的载体“分分子运输输车”（1）分子子运载车车的分类类：质粒：常存在在于原核核细胞和和酵母菌菌中，是是一种分分子质量量较小的的环状的的裸露的的DNAA分子，独独立于拟拟核之外外。病毒：常用的的病毒有有噬菌体体、动植植物病毒毒等。（2）运载载体使用用的目的的：是用它它做运载载工具，将将目的

5、基基因转运运到宿主主细胞中中去。是利用用它在受受体细胞胞内对目目的基因因进行大大量复制制。（3）作为为运载体体必须具具备的条条件：在宿主主细胞中中保存下下来并大大量复制制 有多个个限制性性内切酶酶切点 有一定定的标志志基因，便便于筛选选。思维探究：知识点点3、44、5主主要是介介绍DNNA重组组技术的的三种基基本工具具及其作作用。限限制酶“分分子手术术刀”，主主要是介介绍限制制酶的作作用，切切割后产产生的结结果。在在这部分分内容学学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的内容噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物

6、之所以长期进化而不绝灭，有何保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。DNA连接接酶DNAA片段的的“分子子缝合针针”，在在这里同同学们很很容易想想到碱基基互补配配对或DDNA聚聚合酶，这这是很自自然的。但但只考虑虑到碱基基互补配配对原则则还是不不够的，我们可以从原有的知识出发，要想到限制酶切开的DNA中膦酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，这个地方还没有连接起来，又是怎样连接的呢？这样自然而然地想到DNA连接酶。基因进入受受体细胞胞的载体体“分分子运输输车”的的学习内内容，不不能仅仅仅

7、着眼于于记住这这几个条条件，而而应该深深入思考考每一个个条件的的内涵，通过深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件才能充当载体。教材拓展拓展点一 限制制酶所识识别序列列的特点限制酶所识识别的序序列的特特点是：呈现碱碱基互补补对称，无无论是奇奇数个碱碱基还是是偶数个碱碱基，都都可以找找到一条条中心轴轴线，如如图，中中轴线两两侧的双双链DNNA上的的碱基是是反向对对称重复复排列的的。如： 以中中心线为为轴，两两侧碱基基互补对对称； 以 为为轴，两两侧碱基基互补对对称。拓展点二 DNNA连接接酶连接接的是什什么部位位？DNA连接接酶是将将一段DDNA片片段3端的羟羟基与另另一DNNA片段段5端端磷酸

8、基基团上的的羟基连连接起来来形成酯酯键，而而不是连连接互补补碱基之之间的氢氢键。【典题分类类精析】考点一、基基因工程程的概念念例1（220055高考广广东）以以下有关关基因工工程的叙叙述，正正确的是是 （ ）A、基因工工程是细细胞水平平上的生生物工程程 B、基基因工程程的产物物对人类类都是有有益的C、基因工工程产生生的变异异属于人人工诱变变 D、基基因工程程育种的的优点之之一是目目的性强强分析：本题题考查的的知识点点是基因因工程的的概念。解答本本题的关关键是理理解基因因工程的的概念。基因工程是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造(目的性强)和重新组合(基

9、因重组)，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物.但并不是所有的基因产物对人类都有益的。所以选D。 答案：D 点评：正确确理解基基因工程程的概念念是解题题的关键键。 考点二、基基因工程程的基本本工具例2.下列列关于限限制酶的的说法不不正确的的是A限制酶酶广泛存存在于各各种生物物中，微微生物中中很少分分布B一种限限制酶只只能识别别一种特特定的核核苷酸序序列C不同的的限制酶酶切割DDNA的的切点不不同D限制酶酶的作用用是用来来提取目目的基因因分析：此题题主要考考察限制制酶的有有关知识识。解答答本题的的关键是是理解限限制酶的的来源和和限制酶酶的特点点。

10、限制制酶主要要是从原原核生物物中分离离出来的的，并不不是广泛泛存在于于各种生生物中；一种限限制酶能能识别双双链DNNA的某某种特定定核苷酸酸序列，并并且使每每一条链链中特定定部位的的两个核核苷酸之之间的磷磷酸二酯酯键断开开；DNNA分子子经限制制酶切割割形成黏黏性末端端和平末末端两种种。答案：B点评：考察察有关限限制酶的的题目，主主要是考考察限制制酶的特特点，这这一点一一定要牢牢记。例3在基基因工程程中用来来完成基基因的剪剪接的工工具是 A限制酶酶和连接接酶 BB限制制酶和水水解酶C限制酶酶和运载载体 DD连接酶酶和运载载体分析：本题题考查限限制酶和和连接酶酶的有关关知识。解解答本题题的关键键

11、是“剪接”二字，是是既剪又又接。限限制性内内切酶(即限制制酶)是是剪切基基因的“剪刀”，DNNA连接接酶是将将DNAA末端之之间的缝缝隙“缝合”起来的的“基因的的针线”。所以以，剪接接工具是是限制酶酶和连接接酶。答案：A点评：本题题注意审审题，剪剪接是既既剪又接接，需要要限制酶酶和连接接酶。例4有关关基因工工程的叙叙述正确确的是A限制酶酶只在获获取目的的基因时时才用 BB重组组质粒的的形成是是在细胞胞内完成成的C质粒都都可以作作为运载载体D蛋白质质的氨基基酸排列列顺序可可以为合合成目的的基因提提供线索索分析：本题题综合考考察了基基因工程程中所用用到的工工具。在在基因工工程中，不不仅要用用限制酶

12、酶切割目目的基因因，还要要用同一一种限制制酶在质质粒上切切割出一一个切口口，使目目的基因因与质粒粒切口的的黏性末末端能进进行碱基基互补配配对，所所以A错错；重组组质粒是是在细胞胞外进行行的，所所以B错错；并不不是所有有的质粒粒都可作作运载体体，在科科学研究究中，人人们通常常只是用用大肠杆杆菌的质质粒(其其上有抗抗药基因因)作运运载体，所所以C错错；在人人工合成成目的基基因的方方法中，有有一种方方法是根根据已知知蛋白质质的氨基基酸序列列，推测测出相应应的mRRNA序序列，然然后按照照碱基互互补配对对原则，推推测出它它的结构构基因的的核苷酸酸序列，最最后通过过化学方方法，以以单核苷苷酸为原原料合成

13、成目的基基因。所所以D项项正确。答案：D点评：解答答本题时时要综合合考虑基基因工程程的基本本工具的的特点、条条件、适适用范围围。例5下列列哪项通通常不被被用作基基因工程程的运载载体A细菌质质粒 B噬菌体体C动植物物病毒 D细细菌核区区的DNNA分析：本题题考察基基因工程程中的工工具运载体体。解答答本题的的关键是是记住、理理解运载载体必须须具备的的条件和和课本上上讲的常常用运载载体。作作为运载载体必须须具备的的条件：在宿主主细胞中中保存下下来并大大量复制制 有多个个限制性性内切酶酶切点 有一定定的标志志基因，便便于筛选选。记住住常用的的运载体体有：质质粒、噬噬菌体、动动植物病病毒等。细菌的核区由

14、一个大型的环状DNA分子反复折叠缠绕而成，控制着细菌的主要性状，所以一般不被用作基因工程的运载体。答案：D点评：牢记记作为运运载体必必须具备备的3个个条件是是解答本本题的关关键。 考点三、限限制酶所所识别序序列的特点例6220055天津（1）限限制性内内切酶的识别别序列和和切点是是GGATTCC，限制制性内切切酶的的识别序序列和切切点是GAATC。在质质粒上有有酶的一个个切点，在在目的基基因的两两侧各有有1个酶酶的切切点。请画出质质粒被限限制酶切割后后形成的的黏性未未端。_请画出目目的基因因两侧被被限制酶酶切割后后形成的的黏性未未端。_在DNAA连接酶酶的作用用下，上上述两种种不同限限制酶切切

15、割后形形成的黏黏性未端端能否连连接起来来？为什什么？_分析：本题题主要考考察黏性性末端的的知识。解解答本题题的关键键是理解解限制酶酶的特点点。在切切割目的的基因和和运载体体时，一一定要使使用同一一种限制制性内切切酶，这这样，切切出的切切口才一一样，才才能进行行碱基互互补配对对连接起起来。两两个黏性性末端只只要一样样就可以以进行碱碱基互补补配对，再再通过DDNA连连接酶连连接起来来。答案：（11）可以连连接。因因为由两两种限制制性内切切酶切割割后所形形成的黏黏性末端端是相同同的（或或“是可以以互补的的”）。点评：限制制酶所识识别的是是特定的的碱基序序列，并并在特定定部位进进行切割割，限制制酶不同

16、同，所识识别的碱碱基序列列不同，黏黏性末端端不同。但但不同的的粘性末末端有时时是可以以进行拼拼接的，如如：黏性性末端。两两者不要要混淆。 【针对性练练习】1实施基基因工程程第一步步的一种种方法是是把所需需的基因因从供体体细胞内内分离出出来，这这要利用用限制性内切切酶。一一种限制制性内切切酶能识识别DNNA子中中的GAAATTTC顺序序，切点点在G和和A之间间，这是是应用了了酶的A酶的高高效性 B酶的专专一性 CC酶的的多样性性 D酶的催催化活性性受外界界条件影影响2以下说说法正确确的是 A所所有的限限制酶只只能识别别同一种种特定的的核苷酸酸序列BB质粒粒是基因因工程中中惟一的的运载体体C运运载

17、体必必须具备备的条件件之一是是：具有有多个限限制酶切切点，以以便与外外源基因因连接DD基因因治疗主主要是对对有缺陷陷的细胞胞进行修修复3.下列黏黏性末端端属于同同一种限限制性内内切酶切切割的是是（ ）ABCD4.下列四四条DNNA分子子，彼此此间具有有粘性末末端的一一组是 A B C D5依右图图有关基基因工程程的工具具酶功能能的叙述述，不正确的的是 A切断aa处的酶酶为限制制核酸性性内切酶酶 B连接aa处的酶酶为DNNA连接接酶C切断bb处的酶酶为解旋旋酶 D切断bb处的为为限制性性内切酶酶6不属于于质粒被被选为基基因运载载体的理理由是 A能复制制 B有多个个限制酶酶切点C具具有标记记基因

18、D它它是环状状DNAA7.基因工工程技术术也称为为DNAA重组技技术，其其实施必必须具备备的四个个必要条条件是A.目的基基因 限限制性内内切酶 运运载体 体细胞胞 B.重组DDNA RNAA聚合酶酶 限制性性内切酶酶 连接接酶C.工具酶酶 目目的基因因 运运载体 受体细细胞D.模板DDNA 信使RRNA 质粒粒 受体细细胞8下列关关于各种种酶作用用的叙述述，不正正确的是是ADNAA连接酶酶能使不不同脱氧氧核苷酸酸的磷酸酸与脱氧氧核糖连连接BRNAA聚合酶酶能与基基因的特特定位点点结合，催催化遗传传信息的的转录C一种DDNA限限制酶能能识别多多种核苷苷酸序列列，切割割出多种种目的基基因D胰蛋白白

19、酶能作作用于离离体的动动物组织织，使其其分散成成单个细细胞9.下列关关于限制制酶的说说法不正正确的是是A.限制酶酶广泛存存在于各各种生物物中，尤尤其在微微生物细细胞中分分布最多多B.不同的的限制酶酶识别不不同的核核苷酸序序列C.限制酶酶能识别别不同的的核苷酸酸序列，体体现了酶酶的专一一性D.限制酶酶的作用用只是用用来提取取目的基基因10有关关基因工工程的叙叙述中，不正确的是 A.DNAA连接酶酶将黏性性未端的的碱基对对连接起起来 B.限制性性内切酶酶可用于于目的基基因的获获得 C.目的基基因须由由运载体体导入受受体细胞胞 D.人工合合成目的的基因不不用限制制性内切切酶11下图图所示限限制酶切切

20、割基因因分子的的过程，从从图中可可知，该该限制酶酶能识别别的碱基基序列和和切点是是ACTTTAAGG，切点点在C和和T之间间 BCTTTAAAG，切切点在GG和A之之间CGAAATTCC，切点点在G和和A之间间 DGAAATTTC，切切点在CC和T之之间 12.下列列关于质质粒的叙叙述，正正确的是是（）A、质粒是是广泛存存在于细细菌细胞胞中的一一种颗粒粒状细胞胞器B、质粒是是细菌细细胞质中中能够自自主复制制的小型型环状DDNA分分子C、质粒只只有在导导入宿主主细胞后后才能在在宿主细细胞内复复制D、细菌质质粒的复复制过程程一定是是在宿主主细胞外外独立进进行的13科学学家常选选用的细细菌质粒粒往往

21、带带有一个个抗菌素素抗性基基因，该该抗性基基因的主主要作用用是A提高受受体细胞胞在自然然环境中中的耐热热性 B有有利于检检测目的的基因否否导入受受体细胞胞C增加质质粒分子子的相对对分子质质量 D便便于与外外源基因因连接14下图图是基因因工程主主要技术术环节的的一个基基本步骤骤，这一一步需用用到的工工具是ADNAA连接酶酶和解旋旋酶 BDDNA聚聚合酶和和限制性性核酸内内切酶C限制性性核酸内内切酶和和DNAA连接酶酶 DDDNA聚聚合酶和和RNAA聚合酶酶15限制制酶是一一种核酸酸切割酶酶，可辨辨识并切切割DNNA分子子上特定定的核苷苷酸碱基基序列。下下图为四四种限制制酶BaamHII，Ecoo

22、RI，Hinnd以及Bggl的辨识识序列。箭箭头表示示每一种种限制酶酶的特定定切割部部位，其其中哪两两种限制制酶所切切割出来来的DNNA片段段末端可可以互补补黏合？其正确确的末端端互补序序列为何何？ A. BaamHII和EcooRI；末末端互补补序列AATTTB. BaamHII和Hinnd；末端端互补序序列GATTCC. EccoRII和Hinnd；末端端互补序序列AATTTD. BaamHII和BgllII；末末端互补补序列GATTC16在DDNA 测序工工作中，需需要将某某些限制制性内切切核酸酶酶的限制制位点在在 DNNA上定定位，使使其成为为 DNNA 分分子中的的物理参参照点。这这

23、项工作作叫做“限制酶酶图谱的的构建”。假设设有以下下一项实实验：用用限制酶酶 Hinnd，BaamH和二者者的混合合物分别别降解一一个 44kb（11kb即即1千个个碱基对对）大小小的线性性DNAA 分子子，降解解产物分分别进行行凝胶电电泳，在在电场的的作用下下，降解解产物分分开，如如下图所所示。据此分析，这这两种限限制性内内切核酸酸酶在该该DNAA 分子子上的限限制位点点数目是是以下哪哪一组？AHinnd1个，BBamHH2 个 BBHiind2个，BBamHH3个CHinnd2个，BBamHH1 个 DDHiind和BaamH各有2 个17.两个个核酸片片段在适适宜的条条件下，经经X酶的的

24、作用，发发生下述述变化，则则X酶是是A.连接酶酶 B.RRNA聚聚合酶 CC.DNNA聚合合酶 DD.限制制酶18基因因工程中中涉及多多种工具具酶：（1）限制制性内切切酶是一一类能识识别特定定核苷酸酸序列并并在特定定位点切切割双链链DNAA的“基因剪剪刀”。被限限制酶识识别的序序列往往往正反读读顺序相相同，断断裂的位位置交错错，但又又是围绕绕着一个个轴线（对对称轴）对对称排列列，如下下左图。PPstII和EccoRII都是限限制酶。请请补全下下右图中中的互补补链，画画出对称称轴以及及切割后后的产物物。 （2）DNNA连接接酶是基基因操作作的“针线”，其作作用是把把基于 能力而而粘贴在在一起但但

25、存在的的切口封封闭，进进而才可可能形成成有意义义的 。（3）逆转转录酶也也常被用用于基因因工程，其其存在于于 （生物物）中，催催化以 为模板板合成DDNA的的过程。 19.利用用基因工工程生产产蛋白质质药物，经经历了三三个发展展阶段。第第一阶段段，将人人的基因因转入细细菌细胞胞；第二二阶段，将将人的基基因转入入小鼠等等动物的的细胞。前前两个阶阶段都是是进行细细胞培养养，提取取药物。第第三阶段段，将人人的基因因转入活活的动物物体，饲饲养这些些动物，从从乳汁或或尿液中中提取药药物。（1）将人人的基因因转入异异种生物物的细胞胞或个体体内，能能够产生生药物蛋蛋白的原原理是基基因能控控制。（2）人的的基

26、因能能和异种种生物的的基因拼拼接在一一起，是是因为它它们的分分子都具具有双螺螺旋结构构，都是是由四种种_构成，基基因中碱碱基配对对的规律律都是_。（3）人人的基因因在异种种生物细细胞中表表达成蛋蛋白质时时，需要要经过和和翻译两两个步骤骤。在翻翻译中需需要的模模板是，原原料是氨氨基酸，直直接能源源是ATTP，搬搬运工兼兼装配工工是，将将氨基酸酸的肽键键连接成成蛋白质质的场所所是_，“翻翻译”可可理解为为将由_个“字字母”组组成的核核酸“语语言”翻翻译成由由个“字字母”组组成的蛋蛋白质“语语言”，从从整体来来看在翻翻译中充充任着“译译员”。（4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可直接饮用

27、治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：处于不同发育时期的动物都可生产药物。20.在某某一特定定的植物物基因工工程中，用用土壤农农杆菌中中的Tii质粒作作为运载载体。把把目的基基因重组组入Tii质粒上上的T-DNAA片段中中，再将将重组的的T-DDNA插插入植物物细胞的的染色体体DNAA中。(1)科学学家在进进行上述述基因操操作时，要要用同一一种 分别切切割质粒粒和目的的基因，质质粒的黏黏性末端端与目的的基因DDNA片片段的黏黏性末端端就可通通过 而黏黏合。(2)将携携带抗除除草剂基基因的重重组Tii质粒导导入二倍

28、倍体油菜菜细胞，经经培养、筛筛选获得得一株有有抗除草草剂特性性的转基基因植株株。经分分析，该该植株含含有一个个携带目目的基因因的T-DNAA片段，因因此可以以把它看看作是杂杂合子。理理论上，在在该转基基因植株株自交FF1代中，仍仍具有抗抗除草剂剂特性的的植株占占总数的的 ， (3)种植植上述转转基因油油菜，它它所携带带的目的的基因可可以通过过花粉传传递给近近缘物种种，造成成“基因污污染”。如果果把目的的基因导导入叶绿绿体DNNA中，就就可以避避免“基因污污染”，原因因是 。【课后答案案点拨】思考与探究究（P77）1. 不能能。连接接如下： 2和7能能连接形形成：ACCGT TGCCA；4和8能

29、连连接形成成：GAAATTTC CTTTAAGG；3和6能连连接形成成：GCCGC CGCCG；1和5能连连接形成成：CTTGCAAG GACCGTCC。解析：限制制酶具有有特异性性，一种种限制酶酶只能识识别特定定的碱基基序列，并并在特定定的部位位切开。2.联系你你已有的的知识，想想一想，为为什么细细菌中限限制酶不不剪切细细菌本身身的DNNA？解析：迄今今为止，基基因工程程中使用用的限制制酶绝大大部分都都是从细细菌或霉霉菌中提提取出来来的，它它们各自自可以识识别和切切断DNNA上特特定的碱碱基序列列。细菌菌中限制制酶之所所以不切切断自身身DNAA，是因因为微生生物在长长期的进进化过程程中形成成

30、了一套套完善的的防御机机制，对对于外源源入侵的的DNAA可以降降解掉。生生物在长长期演化化过程中中，含有有某种限限制酶的的细胞，其其DNAA分子中中或者不不具备这这种限制制酶的识识别切割割序列，或或者通过过甲基化化酶将甲甲基转移移到所识识别序列列的碱基基上，使使限制酶酶不能将将其切开开。这样样，尽管管细菌中中含有某某种限制制酶也不不会使自自身的DDNA被被切断，并并且可以以防止外外源DNNA的入入侵（本本题不要要求学生生回答的的完全，教教师可参参考教师师用书中中的提示示，根据据学生的的具体情情况，给给予指导导。上述述原则也也应适用用于其他他章节中中有关问问题的回回答。）。3.天然的的DNAA分

31、子可可以直接接用做基基因工程程载体吗吗？为什什么？解析：基因因工程中中作为载载体使用用的DNNA分子子很多都都是质粒粒（pllasmmid），即即独立于于细菌拟拟核处染染色体DDNA之之外的一一种可以以自我复复制、双双链闭环环的裸露露的DNNA分子子。是否否任何质质粒都可可以作为为基因工工程载体体使用呢呢？其实实不然，作作为基因因工程使使用的载载体必需需满足以以下条件件。（1）载体体DNAA必需有有一个或或多个限限制酶的的切割位位点，以以便目的的基因可可以插入入到载体体上去。这这些供目目的基因因插入的的限制酶酶的切点点所处的的位置，还还必须是是在质粒粒本身需需要的基基因片段段之外，这这样才不不

32、至于因因目的基基因的插插入而失失活。（2）载体体DNAA必需具具备自我我复制的的能力，或或整合到到受体染染色体DDNA上上随染色色体DNNA的复复制而同同步复制制。（3）载体体DNAA必需带带有标记记基因，以以便重组组后进行行重组子子的筛选选。（4）载体体DNAA必需是是安全的的，不会会对受体体细胞有有害，或或不能进进入到除除受体细细胞外的的其他生生物细胞胞中去。（5）载体体DNAA分子大大小应适适合，以以便提取取和在体体外进行行操作，太太大就不不便操作作。实际上自然然存在的的质粒DDNA分分子并不不完全具具备上述述条件，都都要进行行人工改改造后才才能用于于基因工工程操作作。4.网上查查询：D

33、DNA连连接酶有有连接单单链DNNA的本本领吗？解析：迄今今为止，所所发现的的DNAA连接酶酶都不具具有连接接单链DDNA的的能力，至至于原因因，现在在还不清清楚，也也许将来来会发现现可以连连接单链链DNAA的酶。P4寻根问问底：根据你所掌掌握的知知识，你你能分析析出限制制酶存在在于原核核生物中中的作用用是什么么吗？解析：原核核生物容容易受到到自然界界外源DDNA的的入侵，但但是，生生物在长长期的进进化过程程中形成成了一套套完善的的防御机机制，以以防止外外来病原原物的侵侵害。限限制酶就就是细菌菌的一种种防御性性工具，当当外源DDNA侵侵入时，会会利用限限制酶将将外源DDNA切切割掉，以以保证自

34、自身的安安全。所所以，限限制酶在在原核生生物中主主要起到到切割外外源DNNA、使使之失效效，从而而达到保保护自身身的目的的。寻根问底（PP6）：DNA连接接酶与DDNA聚聚合酶是是一回事事吗？为为什么？答：不是一一回事。基基因工程程中所用用的连接接酶有两两种：一一种是从从大肠杆杆菌中分分离得到到的，称称之为EE.colli连接接酶。另另一种是是从T44噬菌体体中分离离得到，称称为T44连接酶酶。这两两种连接接酶催化化反应基基本相同同，都是是连接双双链DNNA的缺缺口（nnickk），而而不能连连接单链链DNAA。DNNA连接接酶和DDNA聚聚合酶都都是形成成磷酸二二酯键（在在相邻核核苷酸的的3

35、位碳碳原子上上的羟基基与5位位碳原子子上所连连磷酸基基团的羟羟基之间间形成），那那么，二二者的差差别主要要表现在在什么地地方呢？（1）DNNA聚合合酶只能能将单个个核苷酸酸加到已已有的核核酸片段段的3末端的的羟基上上，形成成磷酸二二酯键；而DNNA连接接酶是在在两个DDNA片片段之间间形成磷磷酸二酯酯键，不不是在单单个核苷苷酸与DDNA片片段之间间形成磷磷酸二酯酯键。（2）DNNA聚合合酶是以以一条DDNA链链为模板板，将单单个核苷苷酸通过过磷酸二二酯键形形成一条条与模板板链互补补的DNNA链；而DNNA连接接酶是将将DNAA双链上上的两个个缺口同同时连接接起来。因因此DNNA连接接酶不需需要

36、模板板。此外，二者者虽然都都是由蛋蛋白质构构成的酶酶，但组组成和性性质各不不相同。模拟制作讨讨论题（PP6）：1. 你模模拟插入入的DNNA片段段能称得得上一个个基因吗吗？提示：不能能。因为为一般基基因有上上千个碱碱基对。2. 如果果你操作作失误，碱碱基不能能配对。可可能是什什么原因因造成的的？解析：可能能是剪切切位点或或连接位位点选得得不对（也也可能是是其他原原因）。P6旁栏思思考题：想一想，具具备什么么条件才才能充当当“分子子运输车车”？解析：能自自我复制制、有一一个或多多个切割割位点、有有标记基基因位点点及对受受体细胞胞无害等等。【拓展阅读读】1.磷酸二二酯键磷酸二酯键键全称为为3,5磷

37、酸二二酯键，是核酸酸中核苷苷酸的连连接方式式，组成成了核酸酸的一级级结构。在在核酸中中一个核核苷酸核核糖上第第3位的的羟基与与下一个个核苷酸酸核糖上上第5位位的磷酸酸羟基脱脱水缩合合成酯键键，该酯酯键称33,55磷酸二二酯键。若若干个核核苷酸间间以3,5磷酸二二酯键连连接成的的多核苷苷酸链为为核酸。在在链的一一端的一一个核苷苷酸核糖糖上第55位连接接的磷酸酸只有一一个酯键键，称此此核苷酸酸为DNNA链的的5磷磷酸末端端或5端。另另一端核核苷酸上上第3位位的羟基基是自由由的，所所以此核核苷酸称称为3羟基末末端或33端。链链内的核核苷酸第第5位上上的磷酸酸已形成成二酯键键，第33位上的的羟基也也已

38、参与与二酯键键的形成成，故称称核苷酸酸残基。2. 影响响限制性性内切酶酶活性的的因素（1）DNNA纯度度在DNNA样品品中若含含有蛋白白质，或或没有去去除干净净制备过过程中所所用的乙乙醇、EEDTAA、SDDS、酚酚、氯仿仿和某些些高浓度度金属离离子，均均会降低低限制酶酶的催化化活性，甚甚至使限限制酶不不起作用用。（2）核酸酸内切限限制酶的的缓冲液液核酸内内切限制制酶的标标准缓冲冲液包括括氯化镁镁、氯化化钠或氯氯化钾、TTriss-HCCL、巯巯基乙醇醇或二硫硫苏糖醇醇(DTTT)以以及牛血血清白蛋蛋白(BBSA)等。使使用所有有限制酶酶均可发发挥活性性的一种种缓冲液液。不同同限制性性内切酶酶

39、对NaaCl浓浓度的要要求不同同，这是是不同限限制酶缓缓冲液组组成上的的一个主主要的不不同。据据此可分分为高盐盐、中盐盐和低盐盐缓冲液液，在进进行双酶酶解或多多酶解时时，若这这些酶切切割可在在同种缓缓冲液中中作用良良好，则则几种酶酶可同时时酶切；若这些些酶所要要求的缓缓冲液有有所不同同，可采采用以下下三种方方法进行行消化反反应：先先用要求求低盐缓缓冲液的的限制性性内切酶酶消化DDNA，然然后补足足适量的的NaCCl，再再用要求求高盐缓缓冲液的的限制酶酶消化；先用一一种酶进进行酶解解，然后后用乙醇醇沉淀酶酶解产物物，再重重悬于另另一缓冲冲液中进进行第二二次酶解解。（3）酶切切消化反反应的温温度D

40、NNA消化化反应的的温度，是是影响限限制内切切酶活性性的一个个重要因因素。不不同的核核酸内切切限制酶酶，具有有各自的的最适反反应温度度。多数数限制内内切酶的的最适反反应温度度是377，少少数限制制性内切切酶的最最适反应应温度高高于或低低于377。（4）DNNA的分分子结构构DNAA分子构构型对核核酸内切切限制酶酶的活性性有很大大影响，如如消化超超螺旋的的DNAA比消化化线性DDNA用用酶量要要高出许许多倍。有些限制酶在消化它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率也有明显差异。限制性内切酶反应的终止 通常是采用65条件下温浴5min；加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度

41、达到10 mol/L）螯合Mg2 ，以终止反应。【五年高考考回放】120006四四川高考考用基基因工程程技术可可使大肠肠杆菌合合成人的的蛋白质质。下列列叙述不不正确的的是( )A常用相相同的限限制性内内切酶处处理目的的基因和和质粒BDNAA连接酶酶和DNNA聚合合酶是构构建重组组质粒必必需的工工具酶C可用含含抗生素素的培养养基检测测大肠杆杆菌中是是否导入入了重组组质粒D导入大大肠杆菌菌的目的的基因不不一定能能成功表表达答案：B 解析：构建建重组质质粒必需需的工具具酶是限限制性内内切酶和和DNAA连接酶酶，其作作用部位位是磷酸酸与脱氧氧核糖之之间的磷磷酸二酯酯键，而而DNAA聚合酶酶的作用用是在

42、DDNA复复制过程程中用于于连接碱碱基间的的氢键，故故B选项项错误。220006江江苏高考考我国国科学家家运用基基因工程程技术，将将苏云金金芽孢杆杆菌的抗抗虫基因因导入棉棉花细胞胞并成功功表达，培培育出了了抗虫棉棉。下列列叙述不不正确的的是 ( )A基因非非编码区区对于抗抗虫基因因在棉花花细胞中中的表达达不可缺缺少B重组DDNA分分子中增增加一个个碱基对对，不一一定导致致毒蛋白白的毒性性丧失C抗虫棉棉的抗虫虫基因可可通过花花粉传递递至近缘缘作物，从从而造成成基因污污染D转基因因棉花是是否具有有抗虫特特性是通通过检测测棉花对对抗生素素抗性来来确定的的答案：D 解析：基因因具有特特异性，一一种基因

43、因只能控控制一种种性状的的表达。抗抗虫基因因能表达达出致毒毒蛋白，导导致害虫虫因食用用抗虫棉棉后死亡亡 ，而而不能产产生对抗抗生素的的抗性。因因此，转转基因棉棉花是否否具有抗抗虫特性性是不能能通过检检测棉花花抗生素素的抗性性对来确确定的。320005江江苏高考考在植物物基因工工程中，用用土壤农农杆菌中中的Tii质粒作作为运载载体把把目的基基因重组组入Tii质粒上上的T-DNAA片段中中，再将将重组的的T-DDNA插插入植物物细胞的的染色体体DNAA中。(1)科学学家在进进行上述述基因操操作时，要要用同一一种 分别别切割质质粒和目目的基因因，质粒粒的黏性性末端与与目的基基因DNNA片段段的黏性性末端就就可通过过 而而黏合。(2)将携携带抗除除草剂基基因的重重组Tii质粒导导入二倍倍体油菜菜细胞，经经培养、筛筛选获得得一株有有抗除草草剂特性性的转基基因植株株。经分分析，该该植株含含有一个个携带目目的基因因的T-DNAA片段，因因此可以以把它看看作是杂杂合