儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用69张课件

1、儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用1、不要轻言放弃，否则对不起自己。2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔卡耐基。3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有久久不会退去的余香。4、守业的最好办法就是不断的发展。5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮回里有你。儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用1、不要轻言放弃，否则对不起自己。2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远

2、的人，常是愿意去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔卡耐基。3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有久久不会退去的余香。4、守业的最好办法就是不断的发展。5、当爱不能完美，我宁愿选择无悔，不管来生多么美丽，我不愿失去今生对你的记忆，我不求天长地久的美景，我只要生生世世的轮回里有你。儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用磐安县人民医院 申屠桥民一、儿科常见疱疹类病毒感染的病原体种类、危害及诊治现状语言是文化的表现形式，通过这种表现形式能够反映出我国传统文化的内涵与内容，还能通过语言来反映我国人民的文化特征与特点，这需要对我国人文与文化环境有所了解和掌握

3、。虽然说我国的学生在学习英语的过程中掌握了较为丰富的英语词汇，但是仍然有很多学生不能够流利用英语进行交流。之所以出现这样的问题，主要原因就在于学生对外国的文化背景缺乏了解，没有将英语思维应用到学习过程中。如果学生们在用英语进行交流的过程中没有使用英语思维，就会对交流的速度和准确性产生消极影响。所以说，英语和汉语这两种不同的语言，它们的不同之处不单单表现在语音、语法以及结构等多方面，还主要表现在双方思维方式上：中国人具备整体思维，而西方人主要是个体思维。 一、思维方式差异对语言产生的影响 （一）汉英语言逻辑顺序不一样 1.把握对象的思维方式不同 中国人在把握对象的时候通常使用的是综合性思维，他们

4、不会从一开始就准确地指出一个概念的含义，通常是在一种动态的过程中，根据上下文语境进行确定含义。举例来说：“你吃饭了没有？”在上面这句话中，饭主要包括：早饭、午饭、晚饭。在说这句话的时候人们通常不需要明确指出，这是因为可以根据说话的时间来确定饭具体指什么。同样的一个词语，在英文中则会被译为“breakfast”“lunch”“supper”，分得十分清楚。 2.汉英逻辑顺序不同 在汉语当中，往往是按照先因后果的逻辑顺序，先假设后论证，按照由远及近、由大到小的秩序进行排列。然而在英语当中，可以通过多样的连接词进行表示，主要按照含义与自身的结构进行灵活性安排。举例来说，在对时间进行表示的问题上，英语

5、中主要是由小到大排列，即分、时、日、月、年；在汉语中主要是由大到小排列，即年、月、日、时、分。 （二）英汉双方在形态与功能方面的差异 在英语中，每一种语法意义都会有一个明确的方式来表达出来，并且具有较为具体的标志。举例来说，名词复数+S或者+ES；一般将来时加动词原形。通过对英语汉语的比较来看，英语更加注重以形统意，而汉语在对词语、短语、句子的形式方面没有确定的标志，更多的是依靠整体关系来确定的。举例来说，在句子“我今天有事”中，“我”是这句话中的话题，说明部分是“今天有事”。这句话在上下文联系的前提下，便可以表述为“今天有事”。在这句话中话题“我”可以省略，这一省略主要体现出了汉语中的意合，

6、本质上表现的是一种整体思维。对于英汉双方教学的特点来说，教师在英语教学中不单要培养学生听说读写的能力，还要培养学生的英文思维能力，帮助学生养成良好的跨文化交际能力。 二、优化小学英语教学中对学生跨文化交际意识的策略 （一）重视在不同情境中对英语词汇的正确运用 单词作为英语学习中的重要部分，已经成为跨文化交际意识培养的重点内容，要想更好地培养快文化交际能力，首先应当从单词和短语入手。另外，在造句上需要有以下几个方面注意。 首先，语域方面。主要指的是在不同条件下运用不同的语言形式。举例来说，当一个人与其他人打招呼的时候，什么时候用“how do you do”，什么时候用“Good Morning

7、”等等。另外，在表示男孩英俊的?r候应当用“handsome”，在表达女孩漂亮的时候应该用“pretty”，诸如此类的问题应当注意避免错误。 其次，搭配方面。主要指的是在英语当中有一些单词的搭配能力比较强，应当加强对重点词语的讲解与应用指导。举例来说，在学习到Man这个词语的时候，就可以扩充学习“policemen”“postman”等等。 再次，同义词、反义词方面。在英文中，英文单词通常可以用同义词、反义词来表达。为了能够更加有效地提升跨文化交际能力，教师应当培养学生注重英文同义词与反义词的合理运用。 （二）突出英美习语和习惯用法的引用介绍 在和英美人士进行交流沟通的过程中，不难发现的是他们

8、经常会使用俚语、习语，而这恰恰是中国人比较头疼的部分。之所以会出现这样的情况，主要原因就在于中国人通常会按照字面意思去理解。举例来说，英美人在说big fish（大人物）的时候，中国人通常会理解成“大鱼”。正是因为东西方文化之间存在较大的差异，所以二者在风俗习惯上是大相径庭的。举例来说，“Im beat”这句话的含义被理解为“我被打了”，而不是“我很累”。要想更加合理地利用这些习惯用语，务必结合上下文情境，还要将习惯用语应用到具体的场景中进行记忆，这样会有效提高记忆效果。英语教师在教学的过程中要根据学生的具体情况来制定教学方法，培养学生使用英文习惯用语的良好习惯。举例来说每天可以在课堂上准备课

9、前1分钟的Free talk，利用这段时间来介绍习惯用语。另外，教师应当提醒学生如果在日常交际的过程中遇到了这些习惯用语，切记要综合分析与应用。之所以要这样做，主要原因就在于成语具有一定的整体性，要想更好地区分，需要弄清楚它们的含义，而不是根据词语表面的意思进行简单的相加。 （三）加强对英语句式和汉语句式语序结构的区别 句子是构成语篇的最重要内容，考虑到中西双方思维模式的差异，会直接影响到双方语言逻辑顺序的不同。构成语篇的最主要内容就是句子，然而考虑到中西双方在思维方式方面存在的不同之处，以及在中英双方语言逻辑顺序上的迥异，这就要求英语教师在对小学生进行英语教学的过程中重视这两种语言句式以及结

10、构上的不同。举例来说：“Its the first day of the new term.”在这句话当中，英语教师应当让学生们掌握“of”的用法，主要指的是这一个词语所构成的结构在中英双方文章中是相反的。如果按照正确的顺序进行翻译，答案应为：“这是新学期的第一天。”再比如说：“那个穿白衣服的女孩是南希。”当学生们对这个句子进行汉译英的时候，应当遵从英语思维将这句话翻译成：“That girl in white is Nancy.”通过这些例子，英语教师应当发现的是在日常教学英语的过程中，要重点对这些学生不容易理解的知识点、语序结构、句型等进行强化练习，从而更好地培养学生英语思维的成长与发展。

11、 （四）联系生活实际，创设真实有效的交际情景 发展语言的本质和主要目的就是为了交际沟通，要想在英语教学过程中培养学生跨文化交际的能力，就应当在模拟场景中对学生展开行之有效的活动。在英语课堂的日常交流活动中，表演是其中具有一定特色的方法。英语教师们可以在当前的教学课堂上多利用现代化教学手段，通过这些教学手段来更好地活跃课堂氛围，让学生可以在生活场景中学会使用英语，从而更好地交流。教师们可以通过现代化多媒体手段来活跃课堂气氛，让学生们在生活与情境中学会交流。举例来说，教师在讲授购买水果这一刻的时候，可以先给同学们做示范，再让学生们找课下时间在父母的陪同下一起购买水果，在课堂上将自己的所见所闻准确表

12、达出来，并且按照购买水果时的场景展开交际活动，可以通过编造对话的形式来使这一活动变得丰富多彩。在以上这些对话过程中，无一不反映了西方文化的背景知识，通过这些对话我们可以看出在西方服务人员的热情与优质服务。与此同时，教师还可以精心组织学生们为一位过生日的同学设计一组对话，并在举办生日宴会的时候先让他们对西方人当面拆礼物的习惯有所了解，这样一来，学生们可以在对话过程中表达自己的谢意。学生们一旦了解到西方文化中的这一习俗，便可以在对话与沟通的过程中变得更加流畅、自然。举例来说： A： This present is for you. Please open and have a look. B：Oh

13、，how nice！ I like it very much. Thank you. 通过以上这一组对话，我们可以做到让学生们通过对话身临其境，让学生们在课堂上就能感受到对话中的独特魅力。通过对英语的展示和学习，有效地激发了学生自身对英语学习的兴趣和爱好，从而使得他们有更多的兴趣来学习外国的风俗文化。 （五）讲究阅读教学方法，提高学生跨文化意识 为了能够更加有效地帮助学生提高跨文化交际意识和能力，英语教师们可以适当地选择一些课外阅读文章与书籍，通过这些来有目的地让学生们对英美国家人们的生活习惯、家庭关系、教育方式以及社会背景等多方面内容进行了解和掌握。教师还应在日常教学的过程中加强对相关文化知

14、识介绍的教学方法，主要包括以下几点： 首先是直接阐释法。对于这一方法的利用，英语教师可以在对英文阅读材料的讲解过程中注意，哪个知识点是学生容易产生困惑的地方。举例来说，学生遇到了困难的文化点等现象，需要教师对这一内容进行直接的解释。如“boss”一词在英美文化当中一般指的是自己的上司，而在中国文化当中这一词主要指的是老板、拥有企业的人或者大款。又如，在日常阅读练习中，多数还会遇到以下问题： A：How about my watch？ B：Thats very nice A：_.” 有很多同?W当看到这道题的时候，会选择答案“Thank you”。虽然说这个答案和问题十分相配，但是这却是在用中国

15、人的思维去考虑外国的背景与习惯。以上的这个例子充分证明了，只有对英美国家的文化背景与风俗习惯进行了详细了解，才能选择正确答案，这就要求英语教师要提高对学生跨文化交际意识的培养发展。 其次是比较学习法。应当将英文阅读文章中关于文化因素的内容与汉语相关内容进行比较，只有这样才能有效地将二者进行区分。举例来说，对于称赞来讲，中英双方就有不同的理解和接受方式。在中国，人们一旦接受了别人的称赞，通常会表现出不太好意思接受的样子，往往是推脱一番之后才接受；而在西方，人们通常会十分愉快地接受并表示感谢。通过这种对比我们可以发现，就是通过运用比较法，才使得学生们清楚地意识到双方文化存在的差异，从而有效提高学生

16、跨文化交际的意识和能力。 【学生怕作文，农村学生更怕作文。农村学生相较于城里学生而言，他们生活中可感知的新鲜事物稀少，可供阅读的书籍匮乏，社交能力更无法与城里孩子相比。这些困境和现状相信每一个在农村从事过教育工作的人都会有体会。在农村小学从事语文教学过程中，我在作文教学中我花了不少心血，但收效平平。在一次次失望中我开始反思我所运用的指导方法是否最适合农村孩子，如何突破，才走出一条更有助于提高农村学生作文水平的训练方法。 基于此，本人结合教学实践谈谈农村小学语文教学中作文训练的有效方法。 一、培养学生的写作兴趣 俗话说“兴趣是最好的老师”，兴趣也是指导学生写作文的最好的老师。在教学过程中，教师的

17、目的就是要激发学生的写作热情，让学生发自内心的喜欢写作，在生活中积累写作的素材。首先，教师在作文教学中所选的教学内容要贴近农村孩子的心灵；其次，要尽可能地贴近学生实际生活；第三，要把老师的架子放下来，与学生融为一体，跟学生用商量的语气该写什么，怎么样写。学生只要对作文产生了浓厚的兴趣，就会留心观察，分析周围的每一个人，每一件事，每一处景物，写起文章来自然合情若泉涌，滔滔不绝。 二、注重平时的素材积累 作文也像语文基础知识、阅读一样需要积累，比如好词、句、精彩片段等。首先，要用到学生根据课文内容来积累 。新课标要求要重视文本，很多课文的思考练习中都出现“背诵自己喜欢的自然段，摘抄好词、佳句”这样

18、的练习，让学生在背诵时感受语言文字的优美，摘抄中积累材料。如果学生能掌握一些好词佳句就为写作做好了铺垫，能够让他们有词可用、有话可说。坚持写日记是积累材料的是最好方式，也是练笔的最佳途径。 三、培养学生的观察能力 对于农村孩子来说，农村自然风景，乡土气息浓厚。教师要利用这种优势，引导学生仔细观察，使他们“触景生情”。把这种情景教育引进小学作文教学中，会收到事半功倍的效果。如写一写家中养的猫，教师可引导学生观察猫吃食、猫睡觉、猫捉老鼠等等，帮他们列出观察项目，学生就会有目的的观察，写作时就不会无话可说了。让学生每天回忆发生的事，说一说、议一议，写一写，久而久之，学生就知道了什么事是有价值的了。事

19、不在大小，在事情的内容。指导学生写自己熟悉而又真实的生活，而不是写那些“虚构生活”让学生知道，说真话、写事实、叙真情就是作文。 四、让学生在活动中写作 农村孩子由于阅力浅，词汇积累少，有很多事物会说不会表达，在作文课堂中创设操作情境，引导学生做一做，想一想，说一说，写一写。如：提供简单几何图形，启发学生任意拼一拼，然后根据拼得的事物做想像作文，鼓励学生利用自已手中报刊上面的图画剪一剪，贴一贴或画一画，然后再展开想象进行创编故事，指导学生做一做或试一试（小制作、小实验）等，然后练写小制作、小实验报告，在这种情境中，学生边做边想，做后再想，通过“做”与“写”结合以做促想、促写。因而学生脑中便有了具

20、体感知的形象，从而更容易写出想象丰富、文从字顺的文章。 五、鼓励学生说真话抒真情 农村学生的作文存在一个通病，那就是东拼西凑，毫无感情。所以，我们在作文教学中，应竭力教育学生写真事、说真话、抒真情。当学生说出具有自己特色的话时，教师应大力表扬和肯定。让学生知道真实的东西容易打动人，有特色的语言才能吸引人，有感情的语句才能感动人。在习作中我们不难发现，学生作文总是在赞扬生活，赞扬好人好事，这些固然是好的。但是，我们应该让学生知道，生活中不总是有真、善、美，还有丑与恶。如：人类为了个人利益而破坏环境的种种丑态；邻里之间，同学之间的冲突、矛盾、误会、争吵等，都可以是作文的素材，教师要鼓励学生我手写我

21、心，敢于表达自己的思想。学生实话实说，作文就不再空白无力，而且教师可以以作文为载体，及时对学生进行人格教育。 六、利用好多媒体教学优势 农村学生对外面的世界了解甚少，城市学生有优越的学习环境及良好的学习资源，而农村学生只与优美的大片自然接触，缺乏良好的学习资源。特别在前些年农村学生还不知道什么是电脑，什么是多媒体，什么是远程教育.而今天的农村学生可以利用网络资源，根据教学内容的需求，下载好的学习资料，通过这些好的学习资源，让学生更为直观地了解更多知识。这样既开拓了农村学生的视野，又丰富了农村学生写作的素材。农村学生通过优秀的网络资源，了解丰富的写作素材，写起作文来得心应手，不再是无从下手的现状

22、了，通过丰富的网络资源，农村学生突破了写作困难的障碍。 七、在阅读中丰富写作语言 没有大量的阅读，就没有丰富的语言积累。这就要求学生要大量阅读，要求学生在读书时做到把自己的心真正放到文章里面，使自己的情感流露与作者的情感表达产生强烈的共鸣。因此教师在做好正常教学工作的基础上，一周专门拿出两节课让学生静心读书。阅读即对时事新闻、报刊杂志、网络的阅读；同时诵读古诗词、中华经典名录、现代优秀诗文的诵读。 总之，队农村小学作文教学来说，冰冻三尺非一日之寒，学生的习作水平很难在短时间内迅速提高，因此，作为语文教师应立足实际，正视现实，在教学中掌握学情，循序渐进，因材施教，采用适合农村小学生的教法，走出一

23、条农村小学语文作文教学的新路。儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用1、不要轻言放弃，否则儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用69张课件儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用69张课件儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用69张课件儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用69张课件在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占了90%以上（其中细菌与病毒各占45%左右）。在95重大攻关项目中，成功地创建了16SrRNA基因PCR基因芯片快速、准确诊断不同细菌的感染，使细菌诊断上了一新的台阶，其研究成果也列入了全国新生儿败血症诊断标准。在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占了90%以上（其中细菌与病但病毒的快速

24、早期诊断方法仍未见报道。儿童是祖国的未来，如何早期明确诊断儿童病毒感染将是能否治愈病毒感染的关键。但病毒的快速早期诊断方法仍未见报道。儿童是祖国的未来，如何早2 、儿科疱疹类病毒感染的危害儿童病毒感染造成严重危害涉及儿科与围产医学二大范畴。儿科领域中，病毒感染致死的主要原因是中枢神经系统感染，典型的感染为单纯疱疹病毒型（HSV）所致的脑膜脑炎（HSE）。 2 、儿科疱疹类病毒感染的危害HSE是散发性病毒性脑炎中最常见的病原。其次表现为发热、肝脾淋巴结肿大等原因不明的病毒感染，最具代表性的疾病是传染性单核细胞增多症。目前已知主要是由于EB病毒感染所致。EB病毒还对神经系统危害严重，如引起脑膜脑炎

25、、格林巴利综合症、Fishers综合症等。 HSE是散发性病毒性脑炎中最常见的病原。其次表现为发热、肝脾在围产医学中，病毒感染的危害在于宫内感染，最具典型的是巨细胞病毒（CMV），其次是单纯疱疹病毒型（HSV）。同时，CMV脑炎也是AIDS患者中最常见的并发症。 在围产医学中，病毒感染的危害在于宫内感染，最具典型的是巨细胞疱疹类病毒导致儿童中枢神经系统的感染，不及时治疗往往造成智力低下、惊厥发作、语言不清、神经性耳聋等中枢神经系统严重后遗症，尤其是HSV引起的脑炎，未经治疗死亡率高达70%，而有效的抗病毒药物治疗后可明显改善HSE的愈合，使死亡率降至20-30%，但要确保早期用药。 疱疹类病毒

26、导致儿童中枢神经系统的感染，不及时治疗往往造成智力3 、儿科感染疱疹类病毒的种类造成儿童感染致死的主要病毒是HSV、EBV、HCMV、HSV。这些病毒同属于疱疹类病毒，分别是疱疹病毒（HSV/）、疱疹病毒（HCMV）、疱疹病毒（EBV）。 3 、儿科感染疱疹类病毒的种类疱疹类病毒尚包括水痘带状疱疹病毒（VZV），常易致脑膜脑炎、脊髓炎及神经炎；人疱疹病毒6型（HHV 6）、7型（HHV 7），以及最近发现的HHV 8，已有论据显示坏死性脑炎和Griscellis综合症的病儿脑组织中发现了HHV 6病毒。 疱疹类病毒尚包括水痘带状疱疹病毒（VZV），常易致脑膜脑炎、4、疱疹类病毒感染诊治现状目前

27、，对疱疹病毒感染仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。传统的诊断“金标准”为病毒分离，培养一般需要5-21天，费时费力，且敏感性和特异性均欠佳。大多数情况下，脑炎的特异性病毒检测率仅30%，约2/3的感染者无法用病毒分离获得明确诊断。 4、疱疹类病毒感染诊治现状病毒特异性抗体IgM，在体液中要达到有效浓度需10天左右，同时可与其他病毒感染产生交叉反应，从而使其诊断的敏感性和特异性大大降低。病毒特异性抗体IgM，在体液中要达到有效浓度需10天左右，同而IgG抗体则有95%的患者将维持终生，故IgG抗体的存在只能说明有既往感染，不能说明是现时感染，如要用IgG抗体作为现时感染的诊断依据，必需动态观察其

28、滴度的变化，因而不能满足临床早期诊断的需要。 而IgG抗体则有95%的患者将维持终生，故IgG抗体的存在只聚合酶联反应（PCR）是近十几年来发展起来的分子生物学技术，它可在一定条件下，短时间内（数小时）使病原体基因片段发生上百万倍的扩增，然后用凝胶电泳、核酸杂交、限制性酶切分析、序列检测。 聚合酶联反应（PCR）是近十几年来发展起来的分子生物学技术，近几年来，PCR诊断技术已广泛地应用于临床诊断疱疹类病毒感染，Pozo应用多对引物的多重PCR来诊断疱疹类病毒感染，虽然能区分不同的病毒，但因其引物间可互相干扰，使其敏感性较低。也有人用各种病毒基因的保守区设计不同引物进行PCR扩增，但只能检测一种

29、病毒，易造成漏诊。 近几年来，PCR诊断技术已广泛地应用于临床诊断疱疹类病毒感染因此，许多学者提出能否构建通用引物来对所有疱疹类病毒进行PCR扩增，从而达到能一次性检测所有疱疹类病毒，以及它们的混合感染。 因此，许多学者提出能否构建通用引物来对所有疱疹类病毒进行PC疱疹类病毒是由一组病毒组成，具有许多相似的生物学特征及分子结构。具有高度同源序列的基因为DNA多聚酶基因，它所编码的蛋白质是DNA多聚酶，为病毒复制所必需，该基因为所有疱疹类病毒所共有，且有高度的保守性，理论上可在此区构建通用引物同时对多种疱疹类病毒进行检测。 疱疹类病毒是由一组病毒组成，具有许多相似的生物学特征及分子结Yamamo

30、to曾在此区构建通用引物对35例临床怀疑疱疹病毒感染脑炎患者的脑脊液（CSF）进行PCR扩增，然后进行Southern杂交，检测了6种疱疹类病毒，但未能区分各自不同的病毒。 Yamamoto曾在此区构建通用引物对35例临床怀疑疱疹病毒由于病毒的生物学特性比较复杂，各种病毒差异很大，即使同属疱疹类病毒，其抗病毒药差异甚大。如抑制CMV的更昔洛韦，对EBV无任何作用。阿昔洛韦、泛昔洛韦对HSV、VZV有效，但对CMV无效。因此，只有明确具体的病毒感染才能指导临床用药。 由于病毒的生物学特性比较复杂，各种病毒差异很大，即使同属疱疹国外在这方面也有过尝试，如在疱疹类病毒基因组的保守区设计几对兼并引物进

31、行PCR扩增，虽能检测各种病毒，但该方法操作繁杂、费时费力，不能满足临床需要。国外在这方面也有过尝试，如在疱疹类病毒基因组的保守区设计几对二、浙江省医药卫生科研项目儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用二、浙江省医药卫生科研项目（一）、国内外现状和发展趋势 （一）、国内外现状和发展趋势 检索国内外近15年有关疱疹类病毒的文献，发现国内外传统的诊断“金标准”病毒分离因时间需1-3周，敏感性及特异性欠佳，达不到早期准确诊断的目的。免疫、分子生物学诊断技术一直是希望提高诊断准确性的方向。 检索国内外近15年有关疱疹类病毒的文献，发现国内外传统的诊断特异性IgM、IgG的酶联免疫技术因其出现的时间及维

32、持时间的限制，加之滴度的变化需重复检测，限制了该技术的发展。近10年来，国内外研究的重点主要集中在PCR技术的诊断 。特异性IgM、IgG的酶联免疫技术因其出现的时间及维持时间的病毒特异性引物建立高度敏感的PCR技术已经在临床应用，如我们的研究团队于90年代末成功地建立了套式PCR加限制酶分析检测巨细胞病毒，经实验证明具有高度的特异性与敏感性。 病毒特异性引物建立高度敏感的PCR技术已经在临床应用，如我们然而，疱疹类病毒感染其临床表现相似，有时几种疱疹类病毒同时感染需用多对引物进行多次PCR来检测不同的疱疹类病毒，使得特异性PCR在临床实际诊断中受到限制。 然而，疱疹类病毒感染其临床表现相似，

33、有时几种疱疹类病毒同时感许多学者因此提出构建通用引物扩增所有疱疹类病毒，从而达到一次即能检测所有疱疹类病毒。Bouquillon用通用引物扩增6种疱疹类病毒，Sakulwira等用通用引物扩增5种疱疹类病毒，并用RFLP区分不同的病毒。 许多学者因此提出构建通用引物扩增所有疱疹类病毒，从而达到一次我们的研究团队对儿童常见的疱疹类病毒运用通用引物进行体外DNA扩增，进一步用RFLP、测序等方法区分不同病毒，取得较好结果7，但仍存在需多种酶切、Southern杂交等的烦琐，使得在临床常规使用时受到限制。 我们的研究团队对儿童常见的疱疹类病毒运用通用引物进行体外DN（二）、研究内容、研究目标、拟解决

34、的问题和今后研究思路 （二）、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路 1、研究内容基础部分1、研究内容基础部分（1）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，经计算机查索核酸序列库，选取保守DNA区域设计引物，建立能扩增所有6-8种疱疹类病毒的PCR方法。对标准毒株HSV（F株）、HSV（G株）、CMV（169株）、EBV（B95-8株）、VZV（EF株），以及HHV6（GS株）进行PCR扩增，并选择其他病毒如HBV、细菌（大肠杆菌、金葡菌等）、真菌（新型隐球菌）作为对照，以摸索出进行通用引物PCR所需的最小检出量，及其各自反应体系的适宜条件。 （1）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，

35、经计算机查索核酸（2）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异性引物，建立扩增对各自特异病毒DNA的PCR方法，包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8等的PCR方法。并比较各自特异PCR方法与通用引物PCR检测标准毒株其敏感性、准确性等方面的差异。 （2）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异性引物，建立扩增对各自（3）、经核酸序列GenBank比较，设计各自特异的DNA探针，并进一步分子克隆、序列分析，明确HSV、HHV6的亚型基因，设计HSV/、HHV6A/6B等的特异性探针。 （3）、经核酸序列GenBank比较，设计各自特异的DNA探（4）、对设计的DNA探针末端修饰，微阵

36、列，制作基因芯片。内容包括固相载体的选择、玻片表面修饰、探针末端修饰、微阵列制备技术、核酸探针的固定及杂交。（4）、对设计的DNA探针末端修饰，微阵列，制作基因芯片。内（5）、基因芯片杂交系统参数的确定及检测，包括DNA固液相杂交、荧光标记与检测方法，灵敏度及特异性测定等。（5）、基因芯片杂交系统参数的确定及检测，包括DNA固液相杂2、研究内容临床部分2、研究内容临床部分我院临床有中枢神经系统感染，包括急性、散发性、局灶性脑炎，脑膜脑炎等患儿，收取脑脊液及外周静脉血，对全身不明原因发热、皮疹、黄疸、肝脾肿大等患儿抽取静脉血，进行DNA抽提、PCR扩增，阳性结果进一步进行基因芯片分析。 我院临床

37、有中枢神经系统感染，包括急性、散发性、局灶性脑炎，脑同时对临床标本血清（血浆）进行HSV、EBV、CMV等的特异性IgM、IgG检测。试图调查儿童疱疹病毒感染的实际情况，研究儿童病毒感染的早期诊断价值，发现特定疱疹病毒感染或混合感染情况，以阐明PCR-基因芯片在诊断及区分不同病毒感染时的实际意义。 同时对临床标本血清（血浆）进行HSV、EBV、CMV等的特异在研究过程中，同时设立健康体检儿童的对照组及非病毒感染的脑脊液标本，进行PCR-基因芯片检测，以排除假阳性、假阴性等情况，拟在解决目前病毒感染缺乏早期、快速、准确诊断的问题。 在研究过程中，同时设立健康体检儿童的对照组及非病毒感染的脑脊3、

38、研究目标3、研究目标在疱疹类病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因内设计通用引物扩增所有疱疹类病毒DNA，对其PCR扩增产物进行分子克隆、序列测定，通过序列分析找到各自特异的DNA序列及亚型序列，设计特异探针，建立疱疹病毒DNA基因芯片区分不同病毒感染，为临床疱疹类病毒感染的早期、快速诊断提供有效手段。在疱疹类病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因内设计通用引物扩增4、拟解决的问题4、拟解决的问题（1）、在疱疹病毒的高度同源序列选择通用引物，建立能检测CMV、HSV、VZV、HHV等所有疱疹类病毒的PCR方法。（1）、在疱疹病毒的高度同源序列选择通用引物，建立能检测CM（2）、在疱疹病毒的可变区选择特

39、异DNA探针，并对HSV型与型、HHV6A与HHV6B等亚型进行分子克隆、序列分析，找到各自特异DNA序列，建立基因芯片，区分不同疱疹病毒及其亚型。（2）、在疱疹病毒的可变区选择特异DNA探针，并对HSV型5、今后研究思路5、今后研究思路不断成熟完善PCR-基因芯片技术在临床疱疹类病毒诊断中的应用，研发相关诊断试剂盒；同时探索该技术在其他儿童常见病毒感染中的诊断价值。不断成熟完善PCR-基因芯片技术在临床疱疹类病毒诊断中的应用6、研究方法6、研究方法（1）、在PubMed、GenBank中选取通用引物建立能扩增所有病毒的通用引物PCR方法。选取特异引物建立能扩增特定疱疹病毒的PCR方法。引物合

40、成由上海生工有限公司391型仪合成。（1）、在PubMed、GenBank中选取通用引物建立能扩（2）、经计算机GenBank查阅，在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中，设计6种疱疹类病毒特异DNA探针，对HSV、HHV6体外扩增、序列分析，选择亚型DNA片段，区分不同的亚型。对以上所有DNA片段探针经微阵列，建立基因芯片技术。特异性探针合成及Amino-link修饰及polydT等由日本TaKaLa生物公司完成。（2）、经计算机GenBank查阅，在疱疹类病毒高度同源序列（3）、标准病毒株DNA提取采用分子克隆二版的经典方法，血及CSF DNA抽提采用我院自行建立的快速抽提DNA方法 。（3）、标准病毒株DNA提取采用分子克隆二版的经典方法，血及（4）、血特异性IgM、IgG检测，采用德国欧蒙公司ELISA试剂盒，按说明书操作。（4）、血特异性IgM、IgG检测，采用德国欧蒙公司ELIS（5）、收集临床怀疑疱疹病毒感染的血及CSF标本约100例进行临床验证。标本采集前告知患儿监护人该标本将用于科研研究，并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。（5）、收集临