第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养详解演示文稿

第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养详解演示文稿第一页，共七十四页。优选第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养第二页，共七十四页。不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。第三页，共七十四页。上皮细胞的体外培养许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能；上皮组织还常发生肿瘤。第四页，共七十四页。上皮细胞的基本特征：

1.上皮组织的形态结构

群体依赖性（populationdependence)接触抑制（contactinhibition)2.上皮细胞的极性

贴壁依赖性细胞-贴壁生长生长基质3.上皮细胞间的连接第五页，共七十四页。体外培养的上皮组织细胞的生长生物学1.形态学结构：

均质性、透明性很强，结构不明显第六页，共七十四页。2.体外培养上皮组织的生长与增殖特征(1)

体外培养的特殊条件：

防范微生物污染生长基质的支持特殊的培养基

M199RPMI1640DMEMFamF12无血清培养基

去成纤维细胞第七页，共七十四页。根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。

防范微生物污染第八页，共七十四页。皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。生长基质的支持第九页，共七十四页。M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。特殊的培养基第十页，共七十四页。去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。第十一页，共七十四页。(2)体外培养上皮细胞的形态学变化第十二页，共七十四页。体外培养上皮组织细胞的观察与检测1.一般形态学观察

光镜：形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清

电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液pH变化：颜色变化？培养物的污染情况：

透明度变化？

第十三页，共七十四页。2.组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：

碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：

角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白第十四页，共七十四页。血管内皮细胞的体外培养第十五页，共七十四页。人脐静脉内皮细胞的培养组织来源：

婴儿脐带培养用液：

M199+20%FCSD-Hanks0.1%胶原酶溶液1.主要材料：第十六页，共七十四页。2.培养方法：

分离细胞培养法第十七页，共七十四页。1).

将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2).

用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。3).

用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。4).

消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。5).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。

第十八页，共七十四页。

(1)关于接种材料的制备

取材与消化消化酶、浓度、时间

(2)排除成纤维细胞

传代去除法加肝素培养法(90u/ml)刮除法

(3)关于培养液

(4)关于传代培养5.讨论：第十九页，共七十四页。

(1)光镜检查(2)透射电镜检查：

W-P小体

(3)VIII因子相关抗原的免疫组化检测6.内皮细胞的鉴定：第二十页，共七十四页。肾小管上皮细胞的培养第二十一页，共七十四页。1.主要材料：a.细胞来源：b.无血清培养液：

基础培养液：

DMEM/HamF12(1:1)

添加物：

胰岛素5g/ml转铁蛋白5g/ml硒5g/ml氢化可的松36ng/mlT34ng/mlEGF10g/ml第二十二页，共七十四页。

c.消化液：

0.2%胰蛋白酶d.细胞筛网：

80和100目第二十三页，共七十四页。2.原代培养：切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm380目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养每隔3~4天，更换培养液第二十四页，共七十四页。3.传代培养：4.培养结果：

3d长出细胞5~7d进入对数生长期7~9d融合成单细胞层5.鉴定：抗角蛋白抗体染色（+）第二十五页，共七十四页。6.注意事项：a.分离方法：b.鉴定方法：第二十六页，共七十四页。巨噬细胞的培养

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。

第二十七页，共七十四页。1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头，把液体注入离心管。8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10mlDMEM培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用DMEM液冲洗1一2次，再加新DMEM培养液置CO2温箱中。

第二十八页，共七十四页。巨噬细胞的培养动物：

小鼠、大鼠、兔、人培养基：

EagleMEMRPMI1640HamF12常用的巨噬细胞：

肺泡和腹腔巨噬细胞第二十九页，共七十四页。获取巨噬细胞的方法（一）肺泡巨噬细胞

支气管肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞

1.小鼠腹腔巨噬细胞的获取：

(1)主要材料：实验动物:6周龄小鼠培养液：

10%FCSRPMI1640

第三十页，共七十四页。巨噬细胞的纯化1、原理：

巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2.方法：用帖壁法纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞第三十一页，共七十四页。1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃5％CO2培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mMEDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g10分钟，去上清液。3．用预冷Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g10min，去上清。最后用含10％FBS的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。

用帖壁法纯化巨噬细胞第三十二页，共七十四页。1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。2．4℃中，水平离心1000×g30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞第三十三页，共七十四页。巨噬细胞的接种和培养（一）主要材料：培养液：

RPMI1640等+10~40%FCS+抗生素

（二）实验步骤：

a.冷分离b.调整细胞浓度：2~4×106/mlc.接种培养第三十四页，共七十四页。（三）培养结果：大小：20~50m形态：菱形、星形、圆形功能：吞噬功能增殖情况：不增殖、存活1~3周第三十五页，共七十四页。（四）巨噬细胞的鉴定1.吞噬实验：

加入0.001M(finalcon.)SiO2吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力试验：

0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反复吹打细胞变园但不脱落3.细胞化学试验：

ACP酶染色：棕黑色NSE酶染色：紫蓝色第三十六页，共七十四页。淋巴细胞的培养第三十七页，共七十四页。各类淋巴细胞的主要特征表面标志：

1.表面受体：TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseRT淋巴细胞：第三十八页，共七十四页。

MHCCD2.表面抗原第三十九页，共七十四页。B淋巴细胞1.表面受体

BCRFcRCR丝裂原受体EBVR2.表面抗原

MHC抗原CD抗原（CD19、20、21、23、45）第四十页，共七十四页。血淋巴细胞的分离（一）单个核细胞的分离密度梯度离心法外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。第四十一页，共七十四页。外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

(PBMC)1.092PBMC:Peripheralbloodmononuclearcell第四十二页，共七十四页。1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面4.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染第四十三页，共七十四页。1500rpm,20℃

,30minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、血小板第四十四页，共七十四页。（二）纯淋巴细胞的制备1.玻璃黏附法2.羰基铁粉法第四十五页，共七十四页。（三）T、B淋巴细胞的分离1.T细胞花环沉降法2.尼龙毛柱分离法第四十六页，共七十四页。（四）大颗粒淋巴细胞的分离（五）FACS仪分离（六）免疫磁珠法第四十七页，共七十四页。

三、血淋巴细胞的体外培养应用第四十八页，共七十四页。（一）淋巴细胞转化试验（二）B细胞产生Ig的检查（三）T细胞介导的细胞毒试验（四）NK细胞毒性试验（五）K细胞毒性试验（六）LAK细胞的制备（七）TIL细胞的制备第四十九页，共七十四页。（八）淋巴细胞的体外长期培养1.用IL-2建立T淋巴细胞克隆2.用EB病毒转化B淋巴细胞3.用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株第五十页，共七十四页。肿瘤细胞体外培养第五十一页，共七十四页。肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：

肿瘤细胞在体外的生长生物学特性㈠形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

第五十二页，共七十四页。㈡生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。

第五十三页，共七十四页。永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。

体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。㈢肿瘤细胞永生性第五十四页，共七十四页。（四）浸润性

浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。

（五）异质性

所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（StemCells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。

第五十五页，共七十四页。（六）细胞遗传

大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。

第五十六页，共七十四页。（七）其它

肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的LifeSpan，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。第五十七页，共七十四页。肿瘤细胞的培养方法

肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。

第五十八页，共七十四页。RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺：

上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞DMEM、199、MEM：

肉瘤细胞的培养F12、L-15:

上皮性癌细胞的培养（如肝癌细胞）加:2g/LNaHCO320mmol/LHEPES肿瘤细胞的培养方法：肿瘤细胞体外培养常用的培养基（一）培养液的种类和选择第五十九页，共七十四页。（二）培养液特殊添加剂

常用的促细胞生长因子及使用的终浓度

添加剂终浓度BSA10-5mol/mlTRF5~10ug/mlInsulin5ug/ml氢化可的松10-6mol/mlEGF5ng/mlFGF5ng/mlNGF5ng/ml第六十页，共七十四页。肿瘤组织细胞的原代培养取材：人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细针头穿刺、内窥镜活检等。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。

关键：新鲜、无菌、及时、准确第六十一页，共七十四页。技术-分离纯化分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分离纯化：反复贴壁去除成纤维细胞自然淘汰去除正常细胞利用特异抗原标志筛选法(panning)分亚型流式细胞仪分选克隆建株高转移株的建立：反复接种第六十二页，共七十四页。技术-培养原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。传代培养：增殖力低的细胞需要饲养细胞适当密度,基本长满后传代,前10代不稳定，注意培养条件，适当调整培养基。第六十三页，共七十四页。技术-鉴定与建株鉴定：组织来源、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况注意：不是每一肿瘤组织都能建株第六十四页，共七十四页。肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。第六十五页，共七十四页。成纤维细胞的排除：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。第六十六页，共七十四页。去除成纤维细胞的方法第六十七页，共七十四页。是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。1、机械刮除法：第六十八页，共七十四页。2、反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温