Car-T细胞培养标准操作流程

Car-T细胞培养标准操作流程Car-T细胞培养标准操作流程Car-T细胞培养标准操作流程资料仅供参考文件编号：2022年4月Car-T细胞培养标准操作流程版本号：A修改号：1页次：1.0审核：批准:发布日期：Car-T细胞培养标准操作流程1目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。2范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3责任人：实验员人、临床相关人员。4内容耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150cm2培养瓶，EP管，冻存管试剂：X-VIVO15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。环境：外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。操作：采集接收外周血患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。操作前准备净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。

分离单个核细胞（PBMC）：使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。配平离心1200g（2100r/min）离心20min，慢升慢降。离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。细胞培养：细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度5%，相对饱和湿度95%，细胞培养基PH值。根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中（T150200x106/100ml,T75100x106/50ml,T2550x106/25ml）。混匀放入CO2培养箱培养2小时。取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。根据细胞计数调整细胞浓度ml接种培养瓶中（100-120mlinaT150，50-60mlinaT75，15-29mlinaT25），加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。次日细胞培养1天，调整细胞密度至ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2

100U/ml细胞密度调整至ml继续培养。细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2

100U/ml细胞密度调整至ml继续培养。定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。Car-T细胞收集：确认细胞各项检测己符合要求。根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。细胞运输与保存：核对细胞标签内容，填写回输发放记录。细胞盐水