基因工程的酶学基础课件

基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础1限制性核酸内切酶ＤＮＡ连接酶DNA聚合酶限制性核酸内切酶2限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。限制性核酸内切酶3寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。寄主控制的限制（restriction）4基因工程的酶学基础课件5R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶R/M体系：6

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶7

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解R/M体系的作用：8限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，9Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。Ⅰ型酶：10Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。

Ⅱ型酶11Ⅲ型酶

这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅲ型酶12Ⅱ型酶的基本特性

1.在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的3.因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。Ⅱ型酶的基本特性13核酸内切酶作用后的断裂方式

粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’

核酸内切酶作用后的断裂方式14平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。

平末端15基因工程的酶学基础课件16同裂酶（isoschizomers)

指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。同裂酶（isoschizomers)17同尾酶（isocaudamer）

指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT

同尾酶（isocaudamer）18

杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT杂种位点：GATC

C（BamHⅠ）

CTAGT（BclⅠ）

杂种位点（hybridsite）由一对同19

限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。限制片断的末端连接作用20基因工程的酶学基础课件21限制酶的特性a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。限制酶的特性22限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。限制性核酸内切酶的命名原则：23影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA的纯度：

DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸内切限制酶的用量，

b.扩大酶催化反应的体系（稀释），

c.延长酶催化反应的保温时间。

加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。影响核酸内切酶活性的因素：242.DNA的甲基化程度3.酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度。4.DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。2.DNA的甲基化程度25

核酸内切限制酶标准的缓冲液1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：

不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。

2.Tris-HCl：

维持最适的pH值（pH＝7.4）。

3.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：

维持酶的稳定性。

4.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。核酸内切限制酶标准的缓冲液26核酸内切限制酶对DNA的消化作用1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。a.缩短酶切的消化反应的保温时间b.降低反应的温度（37--4）结束酶的活性。核酸内切限制酶对DNA的消化作用273.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）

3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用28ＤＮＡ连接酶（DNAligase）与分子的体外连接ＤＮＡ连接酶（DNAligase）与分子的体外连接29末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）30基因工程的酶学基础课件31用途：1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。3.用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。用途：32碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。碱性磷酸酶：33S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。S1核酸酶：34体外连接的三种方式：

1.用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断

2.用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接

体外连接的三种方式：35ＤＮＡ连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。

只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。ＤＮＡ连接酶：36基因工程的酶学基础课件37基因工程的酶学基础课件38酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺键DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）酶－－AMP（腺苷－磷酸）D39

连接酶的来源1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP连接酶的来源40Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）41基因工程的酶学基础课件42

影响连接酶作用的因素1.反应温度：连接缺口的温度：37度

连接粘性末端的最佳温度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：

平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间

3.提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）影响连接酶作用的因素43

粘性末端DAN片断的连接

由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

粘性末端DAN片断的连接44基因工程的酶学基础课件45

平末端DNA片断的连接1.T4DNA连接酶

2.用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法平末端DNA片断的连接46

同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A47

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无48衔接物连接法

平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A衔接物连接法HpaII49

衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～1250衔接物连接法衔接物连接法51双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成52在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的53DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。DNA接头（adapter）连接法：54基因工程的酶学基础课件55DNA接头连接法DNA接头连接法56

热稳定的连接

从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。寡核苷酸连接测定（oligonucletideligationassay,OLA）

用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。连接酶链式反应（lingasechainreaction,LCR）；也叫连接扩增反应（lingaseamplicationreaction）

用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物，

热稳定的连接57寡核苷酸连接测定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCT

TCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCT

AGTGACCTACCT

待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP阳性信号无信号酶抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性寡核苷酸连接测定待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物58LCR：ligasechainreaction，连接酶链式反应。样品DNA、探针(4)94度变性LCR：ligasechainreaction，连接酶链59DNA聚合酶DNA聚合酶60

常用的DNA聚合酶：

大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反转录酶等。常用的DNA聚合酶：61共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。共同点：62

大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能参与DNA的合成；Pol的功能同DNA的复制有关；PolＩ同DNA分子克隆的关系最为密切。大肠杆菌DNA聚合酶63大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一个具有全部5’3’的外切酶活性。大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ：64

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（较低）。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：65

DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：1、底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2、Mg＋＋离子；

3、带有3’-OH游离基团的引物链；4、DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。

66基因工程的酶学基础课件67

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生；3、DNA的合成可以增强5’3’的核酸外切酶活性；4、5’3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’5’的水解作用位点是分开的。DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性68

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。

对酶活的影响：

反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’3’的聚合酶活性所抑制。

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性69

70

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

DNA缺口转移（nicktranslation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：71

DNA杂交探针的制备

典型的反应体系是。在25μl总体积中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的断裂或缺口；

PolＩ

：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。DNA杂交探针的制备72

dNTP对PolＩ酶活性的影响

在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高浓度的dNTPs（20μmol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（DnaseＩ数量）。

dNTP对PolＩ酶活性的影响73

Klenow片断与DNA末端标记

1、Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000dal的大片断分子。仍具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性，失去了全酶的5’3’外切酶活性。

Klenow片断与DNA末端标记74Klenow片断的主要用途：

1、修补经限制酶消化的DNA所形成的3’隐蔽末端；2、标记DNA片断的末端；3、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；4、DNA序列的测定。Klenow片断的主要用途：75

DNA片断末端标记：

具有3’隐蔽末端的带标记得的DNA片断5’GATCT…3’3’A…5’在反应物中加入Klenow聚合酶α-32p-dGTP,一道温育后生成：5’GATCT…3’3’32pGA…5’或是同时加入α-32p-dATP＋dGTP5’GATCT…3’3’32pAGA…5’DNA片断末端标记：76

DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有5’突出末端的DNA分子。DNA片断末端标记可以作为用凝77

T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断

1、从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的外切酶活性。2、在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3’外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3’5’的方向从3’-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。3、在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的α-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

T4DNA聚合酶和78

合成取代法优于缺口转移法：

1、不会出现发夹结构而缺口转移制备的探针会出现这种结构；2、应用适宜的核酸内切限制酶切割，便可很容易的变成特定序列的探针。合成取代法优于缺口转移法：79具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合成作用产生选择性标记T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针具EcoR1位点的DNA分子对DNA分子3‘端有控制的降解合80

反转录酶：具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5’突出末端的DNA片断作末端标记。反转录酶：81基因工程的酶学基础课件82基因工程的酶学基础课件83

合成cDNA的主要步骤：

1、应用poly(A)mRNA为模板，以12~18个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链;2、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成；3、用SＩ核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。4、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。合成cDNA的主要步骤：84T7DNA聚合酶：

1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种核酸酶。

具有5’3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’5’核酸外切酶活性。T7DNA聚合酶：85

T7DNA聚合酶的用途：1、用于对大分子量模板的延伸合成；

（不受DNA二级结构的影响，聚合能力较强可延伸合成数千个核苷酸）

2、通过延伸或取代合成法标记DNA3’末端3、将双链DNA的5’或3’突出末端转变成平末端的结构。T7DNA聚合酶的用途：86

修饰的T7DNA聚合酶对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3’5’的外切酶活性。聚合作用的速率增加了3倍。修饰的T7DNA聚合酶87

用途：1、作为一种DNA序列分析的工具酶：

加工性能高；无3’5’的外切酶活性；具有催化脱氧核糖类似物聚合的能力。

2、制备探针；可催化较低水平的dNTP（<0.1μmol/L）参入。

3、有效的填补和标记具有5’突出末端的DNA片断的3’-末端。

聚合作用高；失去了3’5’的外切酶活性用途：88基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础89限制性核酸内切酶ＤＮＡ连接酶DNA聚合酶限制性核酸内切酶90限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。限制性核酸内切酶91寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。寄主控制的限制（restriction）92基因工程的酶学基础课件93R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶R/M体系：94

E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶95

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解R/M体系的作用：96限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：

Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，97Ⅰ型酶：

1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。Ⅰ型酶：98Ⅱ型酶

1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。

Ⅱ型酶99Ⅲ型酶

这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅲ型酶100Ⅱ型酶的基本特性

1.在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的3.因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。Ⅱ型酶的基本特性101核酸内切酶作用后的断裂方式

粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’

核酸内切酶作用后的断裂方式102平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。

平末端103基因工程的酶学基础课件104同裂酶（isoschizomers)

指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。同裂酶（isoschizomers)105同尾酶（isocaudamer）

指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。

一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT

同尾酶（isocaudamer）106

杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。

BamHⅠGGATCCBclⅠTGATC

ACCTAGGACTAGT杂种位点：GATC

C（BamHⅠ）

CTAGT（BclⅠ）

杂种位点（hybridsite）由一对同107

限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。限制片断的末端连接作用108基因工程的酶学基础课件109限制酶的特性a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。限制酶的特性110限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。限制性核酸内切酶的命名原则：111影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA的纯度：

DNase的污染(Mg++)

a.增加核酸内切限制酶的用量，

b.扩大酶催化反应的体系（稀释），

c.延长酶催化反应的保温时间。

加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。影响核酸内切酶活性的因素：1122.DNA的甲基化程度3.酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度。4.DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。2.DNA的甲基化程度113

核酸内切限制酶标准的缓冲液1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：

不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。

2.Tris-HCl：

维持最适的pH值（pH＝7.4）。

3.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：

维持酶的稳定性。

4.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。核酸内切限制酶标准的缓冲液114核酸内切限制酶对DNA的消化作用1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。a.缩短酶切的消化反应的保温时间b.降低反应的温度（37--4）结束酶的活性。核酸内切限制酶对DNA的消化作用1153.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）

3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用116ＤＮＡ连接酶（DNAligase）与分子的体外连接ＤＮＡ连接酶（DNAligase）与分子的体外连接117末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）118基因工程的酶学基础课件119用途：1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。3.用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。用途：120碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。碱性磷酸酶：121S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。S1核酸酶：122体外连接的三种方式：

1.用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断

2.用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接

体外连接的三种方式：123ＤＮＡ连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。

只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。ＤＮＡ连接酶：124基因工程的酶学基础课件125基因工程的酶学基础课件126酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺键DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）酶－－AMP（腺苷－磷酸）D127

连接酶的来源1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的

DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATP连接酶的来源128Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）129基因工程的酶学基础课件130

影响连接酶作用的因素1.反应温度：连接缺口的温度：37度

连接粘性末端的最佳温度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：

平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间

3.提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）影响连接酶作用的因素131

粘性末端DAN片断的连接

由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。

粘性末端DAN片断的连接132基因工程的酶学基础课件133

平末端DNA片断的连接1.T4DNA连接酶

2.用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法平末端DNA片断的连接134

同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A135

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无136衔接物连接法

平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。

HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A衔接物连接法HpaII137

衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12138衔接物连接法衔接物连接法139双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成140在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的141DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。DNA接头（adapter）连接法：142基因工程的酶学基础课件143DNA接头连接法DNA接头连接法144

热稳定的连接

从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。寡核苷酸连接测定（oligonucletideligationassay,OLA）

用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。连接酶链式反应（lingasechainreaction,LCR）；也叫连接扩增反应（lingaseamplicationreaction）

用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物，

热稳定的连接145寡核苷酸连接测定

AGTGACCTTCACTGGA

AGTGACCTAGT

T

ACCT

TCACTGGATCACTGGA

AGTGACCTACCT

AGTGACCTACCT

待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP阳性信号无信号酶抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性寡核苷酸连接测定待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物146LCR：ligasechainreaction，连接酶链式反应。样品DNA、探针(4)94度变性LCR：ligasechainreaction，连接酶链147DNA聚合酶DNA聚合酶148

常用的DNA聚合酶：

大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、

T7DNA聚合酶、

反转录酶等。常用的DNA聚合酶：149共同点：

把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。共同点：150

大肠杆菌DNA聚合酶

DNA聚合酶Ｉ（PolＩ）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、

PolＩ和Pol的主要功能参与DNA的合成；Pol的功能同DNA的复制有关；PolＩ同DNA分子克隆的关系最为密切。大肠杆菌DNA聚合酶151大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ：

1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为1091000dal。

DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3’5’的外切酶活性和5’3’的聚合酶活性，另一个具有全部5’3’的外切酶活性。大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ：152

DNA聚合酶Ｉ的酶活性：

1.5’3’的聚合酶活性；2.5’3’的外切酶活性；3.3’5’的外切酶活性（较低）。DNA聚合酶Ｉ的酶活性：153

DNA聚合酶Ｉ发挥作用的条件：1、底物：四种脱氧核苷5’-三磷酸（dNTP）；2、Mg＋＋离子；

3、带有3’-OH游离基团的引物链；4、DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。

154基因工程的酶学基础课件155

DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性

1、5’3’的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5’末端数个核苷酸远的一个键上发生；3、DNA的合成可以增强5’3’的核酸外切酶活性；4、5’3’核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及3’5’的水解作用位点是分开的。DNA聚合酶Ｉ5’3’的核酸外切酶活性156

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性

能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3’-OH末端开始向5’的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。

对酶活的影响：

反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5’3’的聚合酶活性所抑制。

DNA聚合酶Ｉ的3’5’核酸外切酶活性157

158

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：

通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。

DNA缺口转移（nicktranslation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ｉ的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸，但polＩ不能在3’-OH和5’-P之间形成一个键，随着5’一侧的核苷酸不断移去，3’一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。

DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：159

DNA杂交探针的制备

典型的反应体系是。在25μl总体积中含有1μg纯化的特定DNA片断，并加入适量的DnaseＩ、PolＩ、α-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。

DnaseＩ：造成DNA分子的断裂或缺口；

PolＩ

：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。DNA杂交探针的制备160

dNTP对PolＩ酶活性的影响

在低浓度dNTPs的条件下，PolＩ具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，PolＩ则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2μmol/L）和高