菌种的保存方法介绍课件

菌种的保存方法介绍

江西省临床检验中心临床微生物实验室经常能够分离到一些有意义的菌种，但接种在平板上的细菌放4℃冰箱只能保存数天，并且细菌在培养基上移种3次后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异[1]，监测日常工作的室内质控用标准菌株也需要长期留存。所以尽可能长期有效地留存菌种对于系统地分析当前流行株的生物学、分子生物学特征及耐药性变迁，医院感染病原学调查、新药临床研究都十分重要的意义。本文介绍几种常用的菌种保存方法

常规保存法

该法操作简单，只需普通冰箱保存，每个临床微生物实验室均可采用。但缺点是留存时间短，传代频繁，菌种易变异。

斜面保存法

⑴普通琼脂斜面保存法：葡萄球菌、肠道杆菌等对营养要求不高的一股细菌可接种于普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏液，以防干涸(但变形杆菌"OX"及伤寒杆"O"菌株宜接种于干燥的琼脂斜面以防变异)。用橡皮塞塞紧，经37℃18-24h培养后，存放于4℃冰箱中，一般可保存3-6个月。

⑵血液琼脂斜面保存法：链球菌及肺炎球菌等对营养要求较高的细菌应接种于血液琼脂斜面上，37℃培养生长后，放4℃冰箱保存。链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎球菌则须4d移种一次。⑶鸡蛋斜面保存法：将细菌接种于鸡蛋斜面上，经37℃18-24h培养后，加无菌液体石蜡至斜面浸液，再超出约1cm，置4℃冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙门氏菌及其它含表面抗原的细菌，可保存3-6个月。⑷吕氏血清斜面：白喉棒状杆菌可保存在该培养基上，其成份为1%葡萄糖肉汤(pH7.4)1份，无菌牛血清或兔血清3份。白喉棒状杆菌在此培养基上生长迅速、旺盛，菌体形态典型，如在培养基中再加入5%-10%的中性甘油，则培养出的白喉棒状杆菌异染颗粒更为明显，单24小时后即衰老成为多形态，很少有异染颗粒，菌体粗大3-4倍，置4℃可保存2周至1个月。砂土管保存法

适用于产芽孢的细菌

低温冷冻保存法

实验室必须配备-20℃以下低温冰箱，冰箱温度越低，保存的时间越长。

湿牛奶冷冻法[3]

材料①保护剂牛奶的准备：新鲜牛奶经脱脂棉反复3次过滤后，10磅10min高压蒸气灭菌后，冰箱保存备用。②菌种管的处理：先经清洁液浸泡1天，之后用清水冲洗，再用蒸馏水浸泡过夜，以达中性，然后管口塞上棉花，经15磅30min高压蒸气灭菌备用。方法将各种细菌种于各自生长良好的平板培养基上，经分纯后在37℃孵箱孵育18h后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，然后用无菌毛细滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部，每管球部约有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃冰箱。抵抗强的细菌至少可保存3年，抵抗力弱的细菌保存不低于2年。

商品化菌种保存管

每只保藏管中含20-25个小珠以及缓冲液，使用时将菌落挑入缓冲液中，混匀，将缓冲液吸去，置-70℃冰箱保存可达10年，-20℃冰箱可保存1-3年。复苏时，只需将小珠接入肉汤或平板上滚动即可。商品化菌种保存管操作简单，但价格偏高。笔者预计随着经济的不断发展和实验室条件的改善，使用的单位将会越来越多。

冷冻真空干燥保存法

该法是目前保存菌种的最佳方法，具有如下几个突出的优点：①适用范围广。除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此方法保藏外，其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期长，成活率高。有人报道保藏在真空冷冻干燥安培管中的真菌成活期长达40多年[5]，一般微生物至少可保存10余年；③微生物在保藏期内可避免其它杂菌污染；④便于携带运输，易实现商品化生产。其缺点为需要一定的设备（冷冻真空干燥机）、操作繁琐等。菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。

该改良法优点有：⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。⑵菌种管抗破损性极佳；⑶菌种管体积超小。⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。笔者使用该改良法近七年，本省发放菌种上万只没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情