左旋多巴验证方法

2方法色谱条件分析柱：YMCPACKMB-ODS柱，2.1mm*150mm,3|im；柱温50°C；流动相：甲醇-0.5%甲酸溶液（30:70）；流速：0.15ml・min-i；进样量：5"。质谱条件扫描方式MRM，雾化气10L・min-1,气帘气10L・min-1,碰撞气4L・min-1,离子源电压5000V,离子源温度500C。检测通道1（L-dopa）198.3/152m/z；检测通道2（IS）258.2/85.2m/z。血样处理取100"人血浆，标准曲线样品或质控样品，加入30"内标工作液（苄丝肼为10yg・ml-1的0.1%甲酸溶液，卡比多巴为1yg・ml-1的0.1%甲酸溶液），涡旋混匀10s,加入0.5%甲酸甲醇溶液300叫4C高速离心10min（14000r・min-1）,吸取上清液100"，涡旋混匀后，取5"进样分析。2.4标准曲线处理左旋多巴和IS的0.1%甲酸溶液浓度均为1.0mg・ml-1，稀释成不同浓度的工作液后，用空表血浆稀释配制成左旋多巴浓度为50、100、200、300、500、800、1000ng・ml-1的标准人血浆样品供测定左旋多巴的标准曲线用。样品分装于聚丙烯试管后，置-20C避光保存，备用。按“2.3”项下处理血浆样品，进样，记录色谱，以左旋多巴浓度为横坐标，左旋多巴与IS的峰面积比值为纵坐标，进行线性回归，求得回归方程。2.5方法属性考察了6个不同来源的血浆样本和志愿者空白血浆对左旋多巴的和IS的峰面积的干扰和定量测定的影响。2.6精密度和回收率测定在4批次验证试验中取标准质控样品（120、360和720ng・ml-i）,按“2.3”项处理，于1日内各测定5份，以后同法连续测定5d,分别计算其日内、日间精密度和方法回收率。取3种浓度（120、360和720ng・ml-i）的健康人标准血样各5份，其峰面积与未经提取的相同量样本（重组液溶液）的峰面积比较，按“2.3”项处理后进相同量的左旋多巴个IS作LC-MS/MS分析，记录峰面积，计算左旋多巴和IS的提取回收率（%）。2.7稳定性试验评估了经过血样处理后的3个浓度质控样品中左旋多巴及IS在4°C自动进样器（4C）中放置0,12,24h的稳定性，以及QC血浆样品经24h冻存后，室温解冻（从-20C至室温）后测定，再如此冷冻，解冻2次，计算3次冻融后的精密度和准确度。3结果质谱分析采用LC-MS/MS法测定，阳离子多反应检测人血浆中左旋多巴浓度。阳离子MRM的产物例子扫描中可见明显的m/z152.0碎片。左旋多巴和IS的离子峰分别为：左旋多巴m/z198.3-152,苄丝肼m/z258.2-85.2,卡比多巴m/z227.2-181.1。在此液相色谱分离条件和质谱条件下，专一性和灵敏度均较理想。流动相由甲醇和0.5%甲酸溶液组成为30:70（V/V），流速为0.15ml・min-1。左旋多巴和IS（苄丝肼/卡比多巴）的保留时间分别约为2.5,2.0和2.6min,每个样品的色谱记录时间为4.5min。血浆中左旋多巴的LC-MS/MS典型色谱图，见图。方法属性测定了6个不同来源的血浆样本对左旋多巴和IS的测定影响以及是否有离子抑制作用。结果，左旋多巴和IS的平均峰面积的变异小于6%,表明6个不同来源的血浆对左旋多巴和IS的离子化合作用影响较小。另外，将已知浓度的标准血浆样品经萃取后的左旋多巴和IS的峰面积，与将等质量的左旋多巴和IS溶液直接进样所得的峰面积比较。可知左旋多巴、IS的萃取回收率分别为60%50%，但不影响左旋多巴的定量。志愿者空白血浆对测定没有影响，其典型色谱图见图标准曲线取系列浓度标准血样，经血样处理后进样分析。以左旋多巴与IS的峰面积比值(Y)为纵坐标、浓度(p,ng・ml-i)为横坐标进行线性回归吗，得标准去边回归方程。以苄丝肼为IS时，线性方程为Y=0.00106p+0.0648(r=0.9962)；以卡比多巴为IS时，线性方程为Y=0.0011p+0.0037(r=0.9967)。结果表明两者线性关系良好。精密度、准确度和回收率本测定法中的准确度和精密度结果见表。本法测定左旋多巴的批内精密度不超过15%，批间精密度不超过10%。批内和批间的准确度分别在95.6%~111%和101%~104%。稳定性试验评估了在3个浓度质控样品中左旋多巴及IS在4°C自动进样器中的稳定性。结果表明，左旋多巴和IS在