免疫学检测技术及应用

免疫学检测技术及应用第一页，共八十五页，2022年，8月28日免疫学检测技术应用：

1.疾病的诊断、治疗效果评价及发病机理探讨：如：感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应、肿瘤等

2.免疫分子的定性、定量测定：如：细胞因子、粘附分子、细胞受体、补体、抗体等第二页，共八十五页，2022年，8月28日

3.抗原物质的定性、定量检测：如：病原微生物及其代谢产物，组织细胞、蛋白质等

4.免疫细胞的分离、鉴定及功能测定：如：T细胞及其亚群等第三页，共八十五页，2022年，8月28日抗原－抗体反应抗原与相应抗体在体内或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。

第四页，共八十五页，2022年，8月28日抗原抗体反应有以下几个特点:1.抗原与抗体结合是特异性结合表位(抗原)——超变区(抗体)2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合

氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Vanderwaal‘sforce)、电子云力的合力。抗原和抗体可解离,性质不变。

第五页，共八十五页，2022年，8月28日3.抗原抗体反应可分为两个阶段（1）特异性结合阶段此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见反应出现（2）可见反应阶段需时较长,数分,数小时或数日出现可见现象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等

4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反应现象,与两者的分子比例密切相关

第六页，共八十五页，2022年，8月28日第七页，共八十五页，2022年，8月28日抗原抗体反应的主要影响因素：

1.电解质:

在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。

2.温度:37℃3.酸碱度:pH6-8第八页，共八十五页，2022年，8月28日抗原抗体反应包括：沉淀反应凝集反应溶解反应补体结合反应中和反应已知抗体检测未知抗原；已知抗原检测未知抗体。第九页，共八十五页，2022年，8月28日Sensitivityofvariorimmunoassays第十页，共八十五页，2022年，8月28日一、沉淀反应(precipitation)

可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。

沉淀反应的试验方法：环状法絮状法琼脂中沉淀法

第十一页，共八十五页，2022年，8月28日琼脂中沉淀反应法：

双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)

单向免疫扩散(singleradialimmunodiffusion)

对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)

火箭电泳(rocketelectrophoresis)

免疫电泳(immunoelectrophoresis)

第十二页，共八十五页，2022年，8月28日第十三页，共八十五页，2022年，8月28日二、凝集反应(agglutination)

颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。第十四页，共八十五页，2022年，8月28日凝集反应包括：

◆直接凝集反应(directagglutination)

◆间接(被动)凝集反应(indirect/passiveagglutination)◆间接凝集抑制试验(indirectagglutinationinhibitiontest)◆协同凝集试验(coagglutinationtest)

◆抗球蛋白试验(antiglobulintest，Coomb’stest)第十五页，共八十五页，2022年，8月28日第十六页，共八十五页，2022年，8月28日三.免疫标记技术用荧光素、同位素、酶及发光等示踪物质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体)的存在或含量的方法。灵敏度：高，1X10-4

～1X10-5ug抗体/ml

应用：微量物质的定性、定量或定位。第十七页，共八十五页，2022年，8月28日免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)（二）免疫酶技术(immunoenzymatictechnique)

（三）同位素标记技术(isotopelabellingtechnique)（四）发光免疫测定(luminescentimmuno-assay,LIA)（五）免疫胶体金标记技术(colloidalgold

／immunogoldstaining)第十八页，共八十五页，2022年，8月28日（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术)

原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等)标记抗体(荧光抗体)，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。免疫荧光技术包括：直接法间接法间接补体增强法

第十九页，共八十五页，2022年，8月28日Directandindirectimmunofluore-scencestainingofmembraneantigen(mAg).第二十页，共八十五页，2022年，8月28日（二）免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)

是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。主要有两种类型：

1.免疫酶染色

2.酶免疫测定（enzymeimmunoassay,EIA）第二十一页，共八十五页，2022年，8月28日1.免疫酶染色(又称免疫组化技术,immunohistochemistrytechnique)

原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察结果。应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。第二十二页，共八十五页，2022年，8月28日2.酶免疫测定

酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)

原理：①将抗原(或抗体)结合于固相载体；②与抗体(或抗原)反应；③加酶底物，酶促反应。灵敏度：2X10-5μg／ml

应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。第二十三页，共八十五页，2022年，8月28日

ELISA法：直接法间接法双抗体夹心法(双位点法)

竞争法第二十四页，共八十五页，2022年，8月28日ELISA第二十五页，共八十五页，2022年，8月28日(三)同位素标记技术(isotope-labellingtechnique)

放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)

是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。

优点：灵敏度高,可检测0.001pg／mL

特异性强应用：微量抗原和抗体检测。缺点：不稳定，废物处理麻烦等。第二十六页，共八十五页，2022年，8月28日（四）发光免疫分析(luminescentimmuno-assay,LIA)

原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。应用：定量检测抗原、抗体。发光分为：化学发光(chemiluminescence)

生物发光（bioluminescence）第二十七页，共八十五页，2022年，8月28日化学发光原理：发光物质激发态分子基态分子释放光子(发光)

化学发光剂：鲁米诺（luminol）反应剂：过氧化阴离子反应剂第二十八页，共八十五页，2022年，8月28日（五）免疫胶体金技术(colloidalgold／immunogoldstaining)

原理：胶体金标记蛋白质(如抗体)+组织细胞(待测)观察结果(用电镜、光镜或肉眼)

应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。

胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)制成特定大小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。第二十九页，共八十五页，2022年，8月28日淋巴细胞的检测技术一.淋巴细胞的分离

1.外周血单个核细胞(淋巴细胞>90%)的分离密度梯度离心法

(密度为1.077)(2000rpm,15min)第三十页，共八十五页，2022年，8月28日2.尼龙纤维分离法：

单个核细胞通过尼龙纤维柱

B细胞和单核细胞(粘附特性)T细胞(非粘附性)。3.流式细胞术（flowcytometry,FCM）：

荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过FACS分离（荧光素不同）的细胞*FACS：荧光激活细胞分类仪(fluore-scentactivatedcellsorter)第三十一页，共八十五页，2022年，8月28日流式细胞仪第三十二页，共八十五页，2022年，8月28日第三十三页，共八十五页，2022年，8月28日4.磁珠分离术：

(1)直接法：免疫磁珠(磁性微粒结合抗体)+细胞通过磁场分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞

(2)间接法：免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体)+细胞+抗体通过磁场分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞

第三十四页，共八十五页，2022年，8月28日第三十五页，共八十五页，2022年，8月28日

淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法

1．淋巴细胞增殖检测3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）:

间接观察DNA合成含量。灵敏度高，具有放射性。四甲基偶氮唑盐法（MTT）:MTT商品名为噻唑蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）,DMSO使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。第三十六页，共八十五页，2022年，8月28日二甲氧唑黄比色法（XTT）：XTT是一种MTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。第三十七页，共八十五页，2022年，8月28日四唑单钠盐法（WST-1）:WAT-1是一种类似于MTT的水溶性四唑盐，在PMS存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1的水溶液比MTT和XTT稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。Cell-CountingKit-8（CCK-8）:CCK-8中含有WST-8，较WST-1更新的四唑盐，检测原理与WST-1类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。第三十八页，共八十五页，2022年，8月28日（放射性核素摄取法）第三十九页，共八十五页，2022年，8月28日2.细胞毒试验(1)NK细胞的细胞毒活性测定①放射性核素释放法放射性核素标记靶细胞(K562细胞)+效应细胞培养靶细胞破坏，释放放射性核素测cpm值

NK细胞毒活性(%)=100%实验孔cpm值-自然释放孔cpm值最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值第四十页，共八十五页，2022年，8月28日②乳酸脱氢酶(LDH)释放法靶细胞(YAC-1细胞)+效应细胞(小鼠脾胞)LDH释放+LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝)形成甲基化合物(色)测定OD570值

NK细胞毒活性(%)=100%实验孔OD值-自然释放孔OD值最大释放孔OD值-自然释放孔OD值第四十一页，共八十五页，2022年，8月28日

Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity(ADCC）第四十二页，共八十五页，2022年，8月28日第四十三页，共八十五页，2022年，8月28日GenerationofeffectorCTLs第四十四页，共八十五页，2022年，8月28日MHCtetramers第四十五页，共八十五页，2022年，8月28日Twopathwaysoftarget-cellapoptosisstimulatedbyCTLs第四十六页，共八十五页，2022年，8月28日Invitrocell-mediatedlympholysis(CML)assay第四十七页，共八十五页，2022年，8月28日3.酶联免疫斑点法(ELISPOT)

抗原包被B细胞抗体产生并附着第二抗体(酶标记)底物显色抗体(抗细胞因子)包被+T细胞产生细胞因子并与抗体结合+第二抗体(酶标记)底物显色第四十八页，共八十五页，2022年，8月28日第四十九页，共八十五页，2022年，8月28日第五十页，共八十五页，2022年，8月28日第五十一页，共八十五页，2022年，8月28日（二）体内法抗原定量注入皮内，48～72小时后观察结果。结果判定：阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径>0.5cm

弱阳性：硬结直径<0.5cm

阴性：无变化实际意义：阳性——

细胞免疫功能正常者弱阳性或阴性——

多为细胞免疫功能低下者*常用的抗原为结核菌素(OT)、PHA第五十二页，共八十五页，2022年，8月28日皮内注射法第五十三页，共八十五页，2022年，8月28日划痕法第五十四页，共八十五页，2022年，8月28日第五十五页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子的检测技术一、生物学检测技术依赖细胞株测定法二、免疫学检测技术ELISA法三、分子生物学检测技术分子杂交、PCR

等检测mRNA

第五十六页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子检测的特点样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差第五十七页，共八十五页，2022年，8月28日Figure14-12第五十八页，共八十五页，2022年，8月28日第五十九页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子的功能

CellactivationCellgrowthanddifferentiationInductionofMHCInductionofcytokinereceptorsPromotionofantibodyclass-switching第六十页，共八十五页，2022年，8月28日影响细胞因子作用特异性的因素

Onlyantigen-activatedlymphocytesexpressreceptorsDifferentcombinationsofreceptorsubunitsresultinlow-,intermediate-,orhigh-affinityreceptorsRequirementofcell-cellinteractionShorthalf-lifeofcytokinesCytokineantagonistsSynergisticandantagonisticinteractionsamongcytokines第六十一页，共八十五页，2022年，8月28日限制细胞因子临床应用的因素HighlocalconcentrationsofcytokinesduringimmuneresponsecannotbemimickedclinicallyShorthalf-lifeofcytokinesPleiotropiceffectscancauseunpredictableside-effects第六十二页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子的生物学检测检测方法与原理细胞增殖或增殖抑制试验细胞病变抑制试验细胞毒试验细胞趋化试验第六十三页，共八十五页，2022年，8月28日

检测中的操作注意要点靶细胞的选择与培养检测标本的制备显示检测结果2023/1/19第六十四页，共八十五页，2022年，8月28日靶细胞的选择与培养

1、对所测的细胞因子有特异的敏感性

2、易培养、保存、生物学特性稳定

3、有良好的生长状态

4、种属适配2023/1/19第六十五页，共八十五页，2022年，8月28日

各类细胞因子检测的常用靶细胞

细胞因子实验系统干扰因素

IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法

IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法

TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4第六十六页，共八十五页，2022年，8月28日各类细胞因子检测的常用靶细胞

细胞因子实验系统干扰因素

IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法

IL-7Clone-IXN/2b（M）增殖法

IL-8中性粒细胞（M、H）趋化法

GM-CSFTF-1（H）增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）细胞毒法

IFNwish（H）病变保护法IFN-IFN-L929（M）病变保护法IFN-IFN-

第六十七页，共八十五页，2022年，8月28日检测标本的准备

1、分离特定的产生细胞

2、对产生细胞进行诱导、激活

3、选择适当的收集时间2023/1/19第六十八页，共八十五页，2022年，8月28日显示检测结果

1、细胞增殖状态的显示：放射性核素掺入法、胞内酶活性显示法活细胞染色法细胞荧光测定法

2、细胞毒或细胞病变状态的显示活细胞染色法胞内酶活性显示法

DNA断片测定法2023/1/19第六十九页，共八十五页，2022年，8月28日

依赖细胞株测定法PBMC+PHA培养取上清液

+CTLL-2细胞培养+MTT培养测OD570值

第七十页，共八十五页，2022年，8月28日TNF对靶细胞的细胞毒活性

TNF对小鼠L929成纤维细胞株具有细胞毒活性，细胞死亡率与TNF生物学活性成正相关关系。结晶紫染色死细胞

MTT检测活细胞如同时加用转录抑制剂放线菌素D，可提高靶细胞对TNF的敏感性10-100倍。第七十一页，共八十五页，2022年，8月28日

滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意第七十二页，共八十五页，2022年，8月28日

细胞因子的免疫学检测

分泌型细胞因子的检测

ELISAELISPOTRT-PCR（分子生物学）细胞内细胞因子的检测

免疫组化技术第七十三页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子受体的存在形式

膜型细胞因子受体分泌型细胞因子受体2023/1/19第七十四页，共八十五页，2022年，8月28日细胞因子受体的检测方法膜型细胞因子受体的检测：配体检测法抗体检测法分泌型细胞因子受体的检测：标记抗体检测法2023/1/19第七十五页，共八十五页，2022年，8月28日

细胞因子检测临床意义细胞因子正常对照病人疾病年代及受体（pg/ml）（pg/ml）

IL-10.16±0.170.53±0.57肾细胞癌20030.318.8心绞痛199616±6.738.5±28.8胰腺炎1994IL-22.4±0.810.8±1.8急性缺血性综合征1999IL-43.34±0.844.05±1.02支气管高反应性2003IL-654.1485.2疟疾20041.79±2.038.91±13.12肾细胞癌2002

421620败血症20012.1±0.110±1.6风湿20002.554.29非酒精性脂肪肝20031.1±0.118.6±2.1原发性甲状旁腺功1996

能亢进症

4.34±0.997.3±0.97宫外孕1996

12.3±0.894±12.1类风湿关节炎19990.3916关节炎20041.2±0.610.8±1.8急性缺血性综合征1999IL-6受体25.1±1(ng/ml)41.7±1.2(ng/ml)原发性甲状旁腺功能1996（可溶性）亢进症第七十六页，共八十五页，2022年，8月28日

续表细胞因子正常对照病人疾病年代及受体（pg/ml）（pg/ml）IL-863331败血症20013.843.68非酒精性脂肪肝2003

16.31078±181.5泌尿道感染

1993117.6肝癌20034.8±0.527.5±2.6轻度子宫内膜异位症2003530.2±65.1重度子宫内膜异位症IL-1014.11099.3严重疟疾20049.2±1.517.7±4.4非小细胞肺癌200221±4.2转移癌IL-1335.20±12.7092.69±9.87系统性红斑狼疮2005IL-1516.2±435±6腹膜炎