发酵大题范围

参数检测第一页，共45页。例：鸟苷消费在鸟苷发酵中，发现发酵到40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使发酵过程pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进展以下一些测定与分析第二页，共45页。什么因素导致pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累pH下降补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的[NH4+]积累，相应出现产苷速率下降。——代谢不正常第三页，共45页。测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累第四页，共45页。2、氨基酸的积累在有机酸分析的根底上进一步通过HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和[NH4+]积累。第五页，共45页。氨基酸成分分析说明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进展谷氨酸很快被用于菌体合成，在8小时之前已经降到很低程度，并始终维持在低程度，而在48小时左右丙氨酸开场出现明显的积累，发酵液中积累量到达初始量的12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度那么变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低程度。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。第六页，共45页。3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶〔GS〕造成反响抑制和阻遏，使产苷速率降低。第七页，共45页。恶性循环激活磷酸果糖激酶丙酮酸积累氨水补加增加[NH4+]积累抑制GS抑制TCA循环丙酮酸积累EMP流量增加丙氨酸积累第八页，共45页。〔二〕代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径〔EMP〕在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析第九页，共45页。12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以PFK的活力相对较低。24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也根本保持平稳。但是到40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停顿，同时观察到氨基酸和有机酸积累，PFK相对酶活增加，这说明此时通过EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。第十页，共45页。丙酮酸激酶时序分析第十一页，共45页。丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在24小时就根本上到达其最大值，随后维持在恒定的程度，这说明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素磷酸戊糖途径〔HMP〕关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化6－磷酸葡萄糖脱氢生成6－磷酸葡萄糖酸内酯。第十二页，共45页。6－磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活泼，通过HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后根本不变，从而保持EMP和HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到40小时后，6－磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进展而持续下降。根据物料平衡原那么，有可能糖代谢在HMP途径通量下降而EMP途径通量增加。第十三页，共45页。三羧酸(TCA)循环的关键酶三羧酸循环是“消耗〞丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为柠檬酸合成酶，其催化乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反响是三羧酸循环中的第一个限速步骤。第十四页，共45页。柠檬酸合成酶时序分析第十五页，共45页。从图可以看到，TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的程度，这说明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时，TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即代谢流迁移发生在EMP和HMP之间，主要是由于EMP和HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。第十六页，共45页。丙氨酸脱氢酶的时序分析第十七页，共45页。在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据说明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果参加EMP途径的抑制剂，抑制了代谢流迁移的问题，进步了鸟苷的产量第十八页，共45页。基因工程菌第十九页，共45页。〔三〕基因不稳定性消费的目的是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的才能的细胞一般生长得快得多，从而能替代有消费才能的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：别离丧失构造不稳定性宿主细胞调节突变第二十页，共45页。1、别离丧失指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。为什么会出现质粒丧失呢？质粒可分为高拷贝质粒〔>20拷贝/细胞〕和低拷贝质粒〔有时低到每个细胞一至二个拷贝〕。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子细胞承受一些质粒，也有可能有的细胞没有承受质粒，出现质粒丧失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的〔每百万细胞分裂中一个〕。第二十一页，共45页。在大的反响器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反响器中就含有109个无质粒细胞。质粒的别离丧失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是一样质粒附着在一起形成一个单位。第二十二页，共45页。别离丧失示意图第二十三页，共45页。2、质粒构造不稳定性指外源基因从质粒上丧失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。假如质粒发生突变，仍保存了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培养情况就是构造不稳定性。第二十四页，共45页。3、宿主细胞突变

宿主细胞的突变也会造成消费才能的下降。这些突变通常改变细胞调节，结果减少目的蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，假如宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的消费程度。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过参加乳糖或它的构造类似物〔如IPTG〕来启动表达，假如乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的构造类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。第二十五页，共45页。4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。假如变异了的宿主载体系统比原来的宿主-载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。〔四〕表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖构造类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。第二十六页，共45页。进步质粒稳定性的方法1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中参加选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。2、通过控制环境参数〔温度、PH、培养基组分和溶解氧浓度〕，调节比生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反响慢，因此间歇改变培养条件以改变这两种菌的比生长速率，可以改善质粒的稳定性。第二十七页，共45页。染菌第二十八页，共45页。3、不同时间染菌对发酵的影响污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌的时间就长。第二十九页，共45页。〔1〕种子培养期染菌由于接种量较小，消费菌生长一开场不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素〔产物〕或只有很少抗生素〔产物〕。因此它防御杂菌才能低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。第三十页，共45页。〔2〕发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物〔抗生素〕或产生很少，抵御杂菌才能弱。在这个时期要特别警觉以制止染菌的发生。染菌措施可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。假如前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。第三十一页，共45页。〔3〕发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停顿，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施降温培养，减少补料，亲密注意代谢变化情况。假如发酵单位到达一定程度可以提早放罐，或者抗生素消费中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。第三十二页，共45页。〔4〕发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭才能。因此假如染菌不多，对消费影响不大。假如染菌严重，又破坏性较大，可以提早放罐。第三十三页，共45页。带图题第三十四页，共45页。谷氨酸正常发酵与异常发酵溶解氧变化第三十五页，共45页。氧气第三十六页，共45页。实例一对黄色短杆菌生物合成氨基酸时发现：菌体的临界溶氧浓度为当溶氧浓度低于时，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影响，但苯丙氨酸，缬氨酸和亮氨酸最正确合成的溶氧浓度分别为、和。第三十七页，共45页。从合成途径中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸来自于三羧酸循环(TCA)的中间体，而苯丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸来自于糖酵解的中间体，即来自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。第三十八页，共45页。温度第三十九页，共45页。在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系，特别是在80小时以前。从此实验中还可看到，当产生的生物热到达顶峰时，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程1：效价；2：呼吸强度；3：生物热；4：糖浓度第四十页，共45页。第二题第四十一页，共45页。1、微生物对温度的要求不同与它们的膜构造物理化学性质有亲密关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最正确生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。二、微生物与温度相关性的原理第四十二页，共45页。2、蛋白质构造人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的构造完好性和催化功能：(1)通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然构造进展比照；(2)比照同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白构造通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析说明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶构造的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用第四十三页，共45页。嗜冷菌具有在0℃合成蛋白质的才能。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在O0C合成蛋白质，一方面是由于其