微生物细胞破碎2-4

2023/2/5生物分离过程的一般流程本节内容2023/2/5微生物细胞破碎celldisruption第一节细胞壁的组成与结构第二节常用破碎方法第三节破碎率测定第四节包涵体的纯化方法2023/2/5知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。2023/2/5概述(目的和意义)细胞破碎（cellrupture）是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。2023/2/5第一节细胞壁的组成与结构不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。2023/2/51、细菌细胞壁结构细菌的细胞壁都是由肽聚糖、胞壁酸、蛋白质、脂多糖等组成；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围。2023/2/5破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。

革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒病α-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等2023/2/5

2、酵母细胞壁结构最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状；中间一层是糖蛋白；最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物；破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。2023/2/53、真菌细胞壁真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，而且它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。2023/2/5红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图4、植物细胞壁构架物质：纤维素基质：果胶典型结构：胞间层初生壁次生壁2023/2/5微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm主要组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂类蛋白质细胞壁的组成和结构2023/2/5第二节细胞破碎技术2023/2/5机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法

物理破碎温差破碎法压差破碎法化学破碎有机溶剂表面活性剂酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏细胞破碎方法及其原理2023/2/5一、机械法高压匀浆破碎法（homogenization）珠磨破碎法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）2023/2/5采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）1、高压匀浆法（High-pressurehomogenization）细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。2023/2/5高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多：WAB公司的AVPGaulin31MR型Branandluebbe

公司SHL40型意大利Niro

Soavi高压匀浆机2023/2/5高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆器的操作温度上升约２-３℃/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。2023/2/5高压匀浆法适用的范围（大规模细胞破碎的常用方法）☆适用范围

酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）2023/2/5压力压力增加可减少细胞的循环次数，最好一次通过就可完全的破碎。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加。工业生产中，通常采用的压力为55－70Mpa。菌体种类和生长环境大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素2023/2/52）珠磨法beadmill细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。WSK卧式高效全能珠磨机2023/2/53）超声波破碎（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz超声波处理细胞悬浮液。在超声波作用下液体发生空化作用,液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力,引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。2023/2/5JY92-IID超声波细胞粉碎机超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种类型，一般破碎效果后者比前者好。破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。操作过程产生大量的热，操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。2023/2/5适用范围杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，且大规模操作中声能传递和散热有困难，不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。2023/2/5技术原理效果成本举例匀浆法(孔型)须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜不同机械破碎方法的比较2023/2/5二、非机械破碎方法酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广。酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广。酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）2023/2/51、酶解（酶溶法Enymaticlysis)

酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等2023/2/5外加酶法酶解法的特点是专一性强，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，主要用于细菌类细胞壁的裂解。2023/2/5放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，可采用溶菌酶。酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。2023/2/52)酶解-自溶作用

自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。2023/2/5酶解法的特点

优点发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点溶酶价格高溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在

2023/2/5有选择性的加入某些化学试剂，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择性地渗透出来。2、化学渗透法（Chemicalpermeation）取决于化学试剂类型以及细胞壁膜的结构与组成。

常用化学试剂有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等2023/2/5酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法2023/2/5细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）非离子型如TritonX-100和吐温（Tween）等（2）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解2023/2/5能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。（3）有机溶剂（4）EDTA螯合剂处理G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。非极性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸小分子氨基酸静电引力可以渗透过细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构。（5）温和化学渗透剂处理2023/2/5通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒；化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。化学渗透法特点缺点对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。优点2023/2/53、物理法渗透压冲击法冻结-融化法干燥法2023/2/51）渗透压冲击法渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。2023/2/52）冻结-融化法将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次达到破壁作用；一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂；适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。

2023/2/5使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3）干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥2023/2/52023/2/5三、选择破碎方法的依据细胞壁强度和结构(高聚物交联程度、种类和壁厚度)；细胞处理量；目标产物对破碎条件的敏感性；破碎程度；目标产物的选择性释放。2023/2/5四、选择性释放目标产物的一般原则⑴仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结－融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法．当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。2023/2/5(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。2023/2/5

讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究

一.化学法

20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+B.A37℃搅拌高速离心

测上清液酶活。1.处理时间

R%

2.5h2.丁酯用量条件：37℃，搅拌3小时适宜的B.A加量为12%，释放率R=40%12%55%R

%12%2.03U/mg比活2023/2/5二.化学法—冻融法结合

加B.A(12%,37℃搅拌3h）菌悬液冻融(冻结14h，

融化)释放率—55%；比活—2.69u/mg

三.化学—超声波振荡法结合

先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%，小型设备，不能工业大规模生产。四.高压匀浆法

20%(W/V)菌悬液，ΔP=50MPa，N=3。释放率R=38.4%，原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。2023/2/5五.高压匀浆—化学法结合

先高压匀浆，再加10%丁酯，37℃搅拌3h，高速离心(3万rpm)，释放率：R=75%第三节破碎率的测定及破碎技术

的研究方向2023/2/5细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。直接测定法目的产物测定法3)导电率测定法采用染色法区别破碎的细胞与未破碎的细胞如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。一、破碎率的测定2023/2/5二、破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合2023/2/5破碎技术的研究方向

-与上游过程相结合在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂(如青霉素)，使新生细胞细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为宿主细胞，如革兰氏阴性细菌；用基因工程的方法对菌种进行改造。2023/2/5破碎技术研究方向-与下游工程相结合

举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶2023/2/5（inclusionbodiesIBs)第四节包涵体的纯化胞外分泌型表达：离心,收集液相→浓缩→纯化。胞内表达：胞内可溶性表达：离心,收集菌体→细胞破碎→离心，收集上清→纯化。胞内周质表达：离心,收集菌体→低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物→离心,收集上清液→纯化。不溶性包涵体：离心,收集菌体→细胞破碎→离心,收集沉淀→包涵体洗涤→目标蛋白变性溶解→复性→纯化。2023/2/5生物分离过程的一般流程本节内容2023/2/5外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包涵体β-丙酰胺酶20%在细胞间区γ-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素>30%形成包涵体β-内酰胺酶形成间区包涵体人胰岛素原5%~26%形成包涵体2023/2/5包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包涵体的形成的原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态；蛋白质自身不稳定。包涵体的构成2023/2/5基因工程包涵体的纯化方法收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性包涵体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。2023/2/51）包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）