单基因遗传性疾病的分子诊断

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity1单基因遗传性疾病的分子诊断

温州医科大学检验医学院、生命科学学院SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity2

遗传性疾病主要分为两大类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病(特点:病种多、在特定家系中发病率高、对群体的影响小)不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（又称多因素性疾病，特点：病种相对较少、不仅在特定家系中发病率高、而且对群体的影响大）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity3单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁。较常见的有红绿色盲、血友病、白化病等。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity4单基因遗传病常染色体显性遗传病常染色体隐性遗传病X连锁显性遗传病X连锁隐性遗传病Y连锁遗传病SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity5常染色体显性遗传病位于常染色体上的两个等位基因中，如有一个突变，这个突变基因的异常效应就能显示发病。特点：遗传与性别无关，男女发病机会均等；患者双亲往往有一方为患者。家族性多发性结肠息肉、多指、并指等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity6常染色体隐性遗传病致病基因为位于常染色体上的隐性基因，当隐性基因纯合时才能发病。即隐性遗传病

单基因遗传病患者，大多是由两个携带者所生的后代。特点：男女发病机会均等，发病与性别无关；双亲为无病携带者，子女发病概率为25%；常是越代遗传；近亲婚配时，子女中隐性遗传病患病率大为增高。先天性聋哑、白化病、苯丙酮尿症等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity7X连锁显性遗传病特点：女性发病率高，这是由于女性有两条X染色体，获得这一显性致病基因的概率高之故，但病情较男性轻。男性患者病情重，他的全部女儿都将患病。抗维生素D佝偻病、家族性遗传性肾炎等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity8X连锁隐性遗传病特点：女性携带，男性患病。男性的致病基因只能随着X染色体传给女儿，不能传给儿子，称为交叉遗传。血友病A。病因：血浆中抗血友病球蛋白减少，AHG即第Ⅷ因子凝血时间延长。临床表现：轻微创伤即出血不止，不出血时与常人无异。血友病B。病因：血浆中缺乏凝血酶成份PTC，即第Ⅸ因子。临床表现同血友病A。色盲。临床表现：全色盲对所有颜色看成无色，红绿色盲为不能区别红色和绿色。进行性肌营养不良。病因：为原发性横纹肌变性并进行性发展。临床表现：初为行走笨拙，易跌到，登梯及起立时有困难，从仰卧到起立必须先俯卧，双手撑地，再用两手扶小腿、大腿才能站起。进行性肌肉萎缩，但一般不累及面部及手部肌肉。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity9Y连锁遗传病Y连锁遗传病的特点是男性传递给儿子，女性不发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面的基因，其他基因很少，故Y连锁遗传病极少见。目前已经知道的Y伴性遗传的性状或遗传病比较少，肯定的有H－Y抗原基因、外耳道多毛基因和睾丸决定因子基因等。

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遗传病的诊断方法可以简单的分为以下的四类：1.分子水平的诊断：包括限制性片段长度多态性的酶切分析、基因型和单体型的连锁和关联分析、基因的序列分析。2.细胞水平的诊断：采用细胞遗传学技术进行染色体核型分析，比如荧光原位杂交法。3.蛋白质水平的诊断：采用生物化学方法分析异常表达的蛋白质或代谢产物。4.疾病动物模型的辅助诊断：建立相应的转基因疾病动物模型，辅助诊断或判定人类疾病的致病基因。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity11所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关，对这类疾病进行分子诊断有两种策略可供选择：

1.直接诊断策略；

2.间接诊断策略SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity12遗传性疾病分子诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变，如基因的缺失、插入、倍增或者是点突变等遗传缺陷。因此直接诊断的前提是被测基因已经克隆，其核酸序列和结构已被阐明。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity131、点突变的诊断直接诊断策略和方法：直接检测基因点突变：等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特异性扩增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技术等；基因背景未知的点突变：单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析（HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity14

2、片段性突变的检测

片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用Southern印迹技术和多重PCR技术。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity15间接诊断策略和方法：采用多态性连锁分析的方法，寻找具有基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等，并判定被检者是否有这条存在基因缺陷的染色体、相关基因的等位基因型和单倍体型等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity16《医疗机构临床检验项目目录（2013年版）》检验项目1462项：一、临床体液、血液专业（360项）二、临床化学检验专业（347项）三、临床免疫、血清学专业（458项）四、临床微生物学专业（152项）五、临床分子生物学及细胞遗传学检验（145项）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity17五、临床分子生物学及细胞遗传学检验1、感染性疾病分子生物学检验（89项）2、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验（25项）3、肿瘤分子生物学检验（17项）4、用药指导的分子生物学检验（10项）5、其它（4项）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity182、疾病相关分子生物学及细胞遗传学检验染色体核型分析染色体荧光原位杂交分析脆性X染色体核型分析羊水细胞染色体分析高分辨染色体核型分析绒毛组织染色体分析姐妹染色体互换分析染色体分析21三体和性染色体多倍体检测单基因遗传病基因突变检测遗传性肌营养不良基因分析α地中海贫血基因突变检测肝豆状核变性基因分析β地中海贫血基因突变检测血友病基因分析苯丙酮尿症的基因突变检测脆性X综合症基因分析遗传性耳聋基因检测Y染色体性别基因分析HLA低分辨基因分型检测脱氧核糖核酸倍体分析HLA中分辨基因分型检测血细胞荧光原位杂交分析HLA高分辨基因分型检测未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity19主要内容血红蛋白病杜氏肌营养不良症血友病苯丙酮酸尿症成年型多囊肾SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity20导致单基因病产生的基因突变类型基因突变点突变密码子插入或缺失移码突变外显子缺失或重复基因倒位基因融合动态突变SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity21针对单基因病基因突变的分子诊断技术DNA杂交基因酶谱连锁分析寡核苷酸探针杂交PCR基因芯片DNA测序SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity22分子诊断的时机症状前诊断产前诊断着床前诊断症状后诊断SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity23

一、血红蛋白病血红蛋白的构成：2条α珠蛋白（141aa）和2条β珠蛋白（146aa）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity24（一）珠蛋白基因簇的结构α珠蛋白基因簇：16Pter-p13.3

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity25β珠蛋白基因簇：11p15.5

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity26（二）镰状细胞贫血症的分子诊断镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白(Hb)病。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以致慢性局部缺血导致器官组织损害。也是严重危害母子健康的疾病,可使胎儿死亡率达5%，孕妇死亡率达4.62%

。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity27因β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白(HbS)，取代了正常Hb(HbA)。在氧分压下降时HbS分子间相互作用，成为溶解度很低的螺旋形多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞（镰变）。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity28纯合子型：SS，完全没有正常的HbA,预后严重，只有14%活到成年，而多死亡于30岁前。杂合子型：AS，即正常HbA与异常HbS相混。在非洲有35%的病人是AS型基因；其变化悬殊，轻者可活至成年，重者可反复出现危象发作。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity29病因：β珠蛋白基因点突变βA…CCTGAGGAG…βS…CCTGTGGAG…SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity30镰状细胞贫血的分子诊断方法Mst

IICCTGAGGCCTG

TGG突变型野生型1.15kb0.2kb1.35kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity31限制酶切片段电泳后，经SouthernBlot检测1.35kb1.15kb0.2kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity32（三）地中海贫血的分子诊断地中海贫血又称海洋性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态。本病广泛分布于世界许多地区，东南亚即为高发区之一。我国广东、广西、四川多见，长江以南各省区有散发病例，北方则少见。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity33根据所缺乏的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以β和α地中海贫血较为常见。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity34α地中海贫血：大多数是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。

各种表型的α地中海贫血的基因型表型基因型正常人αα/αα静止型α地中海贫血α—/αα标准型α地中海贫血—

—/ααHbH病（β4）α—/—

—HbBart’s（胎儿水肿综合症，γ4）—

—/—

—ζψζψα2ψα1α2α1θ1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity35基因突变：缺失为主遗传方式：不完全显性遗传？--/αα

--/αα--/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity36α地中海贫血的基因诊断BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα基因簇限制性酶切片段和分子杂交探针SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity37限制酶切片段电泳后，经SouthernBlot检测14kb10kbaa/aaaa/a-aa/--a-/----/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity38β地中海贫血：主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。

LCRεGγAγψβ1δβIVS-IIVS-IIβ基因簇和β基因的结构SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity39基因缺失和有些点突变可致β链的生成完全受抑制，称为β0地贫；有些点突变使β链的生成部分受抑制，则称为β+地贫。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity40β地贫基因突变较多，迄今已发现的突变点达100多种，国内已发现28种。其中常见的突变有6种：①β41-42（-TCTT)，约占45%；②IVS-Ⅱ654(C→T)，约占24%；③β17(A→T)；约占14%；④TATA盒-28(A→T)，约占9%；⑤β71-72（+A),约占2%；⑥β26(G→A)，即HbE26，约占2%。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity41

突变类型

分子缺陷

人群1．核苷酸取代(1)β-28核苷酸A→CTATA区转录信号突变，β+中国人(2)βIVS-1第1核苷酸G→A拼接接头突变，导致RNA加工缺陷，β0地中海地区人(3)βIVS-1第5核苷酸G→C共有顺序突变导致RNA加工缺陷，β+印第安人(4)βIVS-2第654核苷酸C→T内含子变化导致RNA加工缺陷，β0中国人(5)β第17密码子A→T无义突变导致无功能RNA，β0中国人(6)HbKnossos(β27丙→丝)编码区突变导致RNA加工缺陷，β+地中海地区人2．

核苷酸插入β密码子71-72间插入1bp移码突变导致无功能mRNA，β0中国人3．

核苷酸缺失β密码子41／42(-4)缺失移码突变导致无功能mRNA，β0中国人SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity42遗传方式：不完全显性遗传β/β0

β/β0β0/β0SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity43在b珠蛋白基因第2内含子第654位核苷酸C→T突变（IVS-II-654C→T，简称b654），是中国人所特有的，而且是最常见的b地贫基因突变之一。654*ABCmRNA(N)mRNA(M)IVSIIVSII579↓73bpIVSIIVSIIb-globingeneb654mRNA的剪接模式SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity44β654基因突变的分子诊断－RT-PCR法诊断剪切异常NormalββPatientββ０

β０

β０254bp181bp轻型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity45β654基因突变的分子诊断－PCR-ASO方法杂交不杂交不杂交杂交正常杂合子轻型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity46反向点杂交同时诊断β基因多个点突变M1M2M3M4M5M6

正常探针突变探针

基因芯片技术现在已经开发了多种诊断β地贫的芯片检测阅读系统，系统多采用国际先进的PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本中β珠蛋白基因上多个基因位点的突变

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity47二、杜氏肌营养不良症（DMD）肌营养不良症由于遗传方式的不同大致可分为以下几类：X染色体隐性遗传的Duchenne型和良性的Becker型常染色体显性遗传的面-肩-肱型常染色体隐性遗传的肢带型在各型肌营养不良症中，Duchenne型发病率最高，病情也严重，常早年致残并导致死亡，是遗传性肌萎缩症中最有代表性的疾病。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity48杜氏肌营养不良是一种X染色体隐性遗传疾病，主要发生于男孩。据统计，全球平均每3500个新生男婴中就有一人罹患此病。患者在学龄前就会因骨骼肌不断退化出现肌肉无力或萎缩，导致不便行走。大概在7岁到12岁时，会彻底丧失行走能力，通常到20多岁就会因为心肌、肺肌无力而死亡。针对该病，医学界尚无有效疗法。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity49（一）遗传方式和DMD基因突变

遗传方式：XRDMD基因定位于Xp21.2，是目前已知人类最大的基因，包括79个外显子基因缺失是DMD发生的主要原因（约占60%~70%）

Xp21.2-p21.1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity51（二）杜氏肌营养不良症的分子诊断多重PCR技术诊断DMD基因缺失Chamberlain设计了9对引物，可同时扩增第4、8、12、17、19、44、45、48和51号外显子Beggs设计了9对引物，可同时扩增启动子、第3、6、13、43、47、50、52和60号外显子18对引物的多重PCR扩增可以检测出DMD基因的98%缺失患者

5’3’PatientsSt(-)(+)12345DMDGENEagfbhcdeabcdefghSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity54多重PCR诊断DMD基因外显子缺失I：外显子45缺失II：外显子48缺失III：正常对照

多重探针连接扩增Multiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA)测序：Sanger双脱氧链末端终止法二代基因测序技术，如杂交测序法（SBH）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity56血友病为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity57三、Ａ型血友病1.血友病A（血友病甲），即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是X染色体隐性遗传疾病。2.血友病B（血友病乙），即因子Ⅸ缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为X染色体隐性遗传。3.血友病C（血友病丙），即因子Ⅺ（FⅪ）缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐性遗传。15～20/10万男孩中有发病，此发病率在所调查的不同的种族和地域之间没有差异。发病率以血友病A最多占85%，血友病B占15%，血友病C罕见。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity58（一）FⅧ的基因结构

FⅧ基因位于X染色体长臂末端（Xq28），包括26个外显子和25个内含子，全长186kb。包括26个外显子和25个内含子，其mRNA全长约为9kb，cDNA为9009bp。其翻译产物为2351个aa残基的多肽链。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity59（二）Ａ型血友病的遗传方式和基因突变遗传方式：XR已报道FⅧ基因点突变174种，缺失117种，插入10种。由于导致HAFⅧ基因的点突变多，故在实际工作中不可能对每一病人作点突变的检测，所以DNA多态性的连锁分析仍然是Ａ型血友病基因诊断的常用手段。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity60A型血友病的分子诊断－PCR-RFLP连锁分析法SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity61血友病A（HemophiliaA,HA）99bp43bp142bpBcl

IBcl

I142bpSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity63Amp-FLP

在FVⅢ区内尚有两个VNTP区，一个位于DXS52，另一个位于DX102内，它仍均具有复杂的多态性，亦可用于连锁分析。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity64其他诊断方法PCR-SSCPPCR-DGGESchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity65SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity66四、苯丙酮酸尿症（PKU）（一）苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变编码PAH的基因发生突变，致使PAH活性降低或丧失

PAH突变种类达440余种，涉及13个外显子，突变的80%发生在外显子5~12编码区

中国人的PAH基因突变类型30余种，已确定20多种，大约占所有基因突变类型的80%

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