【课件】动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体“生物导弹”追踪癌细胞抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故而知新：有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？实例1：自然条件受精作用1970年人工条件下的人-鼠细胞融合实验实例2：人工诱导一、动物细胞融合技术一、动物细胞融合技术1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。3、结果：形成杂交细胞。即融合后形成的原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。2、原理：细胞膜具有一定的流动性4、诱导方式物理法：电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒细胞融合成功的标志：细胞核的融合仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）（1）“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞

正在融合的鸡血细胞5.实例：6.意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能

7.应用：（1）细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。（2）利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。处理方法诱导手段结果原理请同学们看图对比动物和植物细胞融合的异同：植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；PEG融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较抗体概念：特性：分布：浆细胞产生的专门应对抗原的蛋白质特异性即一种抗体只能与一种抗原结合主要分布于血清中，也分布于组织液及外分泌液（乳汁）中。注意:抗体的化学本质一定是蛋白质！二、单克隆抗体的制备1.传统抗体制备方法及缺陷向动物体内反复注射某种抗原从动物血清中分离所需抗体产量低、纯度低、特异性差（2）缺点：（1）方法：如何解决这个问题呢？2.单克隆抗体制备思路：每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体选

择B淋巴细胞不可能无限增殖一个B淋巴细胞B淋巴细胞群

单克隆抗体产生克隆化培养单克隆抗体癌细胞动物细胞融合思考１：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的思考２：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备思考：一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体1975年，米尔斯坦和科勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖用特定抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养多种B淋巴细胞骨髓瘤细胞诱导融合多种杂交细胞3.单克隆抗体制备的过程：PEG融合法电融合法灭活病毒诱导法能产生抗体能大量增殖脾脏中获取2杂交瘤细胞13第一次筛选多种杂交瘤细胞多种杂交细胞骨髓瘤细胞自身融合B细胞自身融合杂交细胞132未融合的B淋巴细胞未融合的骨髓瘤细胞B-骨、骨-骨、B-B、用特定的选择培养基（既能迅速大量增殖，又能产生抗体）克隆化培养抗体检测第二次筛选：(抗原-抗体杂交技术)多种杂交瘤细胞阳性细胞检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）分泌所需抗体的杂交瘤细胞阳性孔第二次筛选：抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的目的和方法是不相同的。将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔多孔细胞培养板分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞多次筛选第一次筛选第二次筛选原因方法目的诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经第一次筛选之后获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基进行筛选用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）筛选获得杂交瘤细胞获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞两次筛选的比较注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取不需要配制培养液，不需要控制培养液无菌、无毒、温度、PH、渗透压、气体环境等条件。杂交瘤细胞体内培养的优点：

补充资料：第一次筛选获得杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基喋呤B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长AB1、AB2、AB3……专一抗体检验阳性：有限稀释法、抗原-抗体杂交法单克隆抗体的制备过程——第二次筛选【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞，培养之后(即克隆化培养)，用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（AB3）。多孔细胞培养板抗体检测板阳性孔单克隆抗体及其应用二

【课堂小结】单克隆抗体筛选二杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养筛选一骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合动物细胞培养单克隆抗体的制备既能大量繁殖又能产生专一抗体特异性强灵敏度高可大量制备注射抗原用特定的选择性培养基克隆化培养、抗体检测应用到的技术：原理：

细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖动物细胞融合、动物细胞培养1.(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的

细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射____________类物质。（2）d过程是一个

的过程，该过程的进行常用_____________或_____________诱导。(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成

种类型的C细胞，因此需用__________培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是

，其特点是_________________________________________。B淋巴

抗原

动物细胞融合

聚乙二醇灭活病毒

选择性3既能无限增殖又能产生特异性抗体

杂交瘤细胞(4)在培养时通过________分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答4项）

（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是

。特异性强、灵敏度高，可大量制备有丝无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pH；适宜的气体环境

小试牛刀单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。三、单克隆抗体的应用1.单克隆抗体的优点：资料1用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。具有准确、高效、简易、快速特点。诊断优点：（1）广泛用作诊断试剂资料2使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体-药物偶联物（antibody-drugconjugates,ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图所示。(2)用于治疗疾病和运载药物抗体药物接头ADC被细胞吞噬释放药物溶酶体裂解细胞凋亡1.ADC的抗体和药物各具有什么作用？讨论抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞；药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物（PD-1抗体或PD-L1抗体）可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点主要用于癌症治疗，如：单克隆抗体+药物=“生物导弹”优点：位置准确、疗效高、副作用小结合同位素的单抗(“生物导弹”—单抗导向，药物为弹头)(2)用于治疗疾病和运载药物课堂小结两个过程动物细胞融合过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法

－－灭活病毒一个新细胞－－杂交瘤细胞一个优势－－单克隆抗体特异性强、灵敏度高、可大量制备的优势

4.单克隆抗体在临床上还有哪些应用？你可以课后搜集资料，然后以“单克隆抗体在临床上的应