人血管生长素的真核表达及亚细胞定位

人血管生长素的真核表达及亚细胞定位张宏斌,武婕,杨太成,冼江,赖晃文,杨传红,郑文岭【关键词】人血管天生素;,真核表达;,定位;,细胞核[摘要]目的:创立人血管天生素〔angigenin,ANG〕的真核表达体系并在细胞内亚定位。要领:接纳亚克隆技能构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP/ANG,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞〔HUVE〕并对转染细胞内pEGFP/ANG的表达用荧光显微镜和免疫组化染色举行断定。用共聚焦显微镜和免疫电镜不雅察ANG的亚细胞定位。效果:荧光显微镜不雅察可见转染的HUVE内发出强绿色荧光。免疫组化染色检测表现,转染的HUVE中有棕色颗粒。共聚焦显微镜及免疫电镜查抄表现,ANG集聚于细胞核区。结论:以构建的重组体pEGFP/ANG转染HUVE后,可表达人ANG卵白;表达的ANG定位于细胞核区。[关键词]人血管天生素;真核表达;定位;细胞核血管天生素〔angigenin,ANG〕是一种相对分子质量(r)为14100、pI为9.5、由123个氨基酸构成的卵白质,存在于正凡人的血浆及实体肿瘤构造中,属于核糖核酸酶超家属成员[1],其基因定位于14号染色体的q11区。ANG具有很强的促进血管天生的作用。大量研究表白,ANG与肿瘤的快速生长和转移有严密的干系[2,3],肺癌、胰腺癌及乳腺癌等患者的外周血中ANG的程度显着升高,并且血清ANG的程度与这些肿瘤的生长及转移呈明显的正相干,因此,通过检测血清ANG的程度可猜测肿瘤的产生与生长环境[4-6]。然而,ANG对付创伤、烧伤及血循环较差的股骨头、半月板等损伤的修复那么具有较大的临床应用代价。为此,我们构建了人ANG基因的真核表达质粒,并转染人脐静脉内皮细胞〔HUVE〕举行表达,断定了其亚细胞定位。1质料和要领1.1质料荧光标识表记标帜试剂盒为leularPrbes公司产物。鼠抗Glgi58K或alnexin单克隆抗体〔Ab〕为Siga公司产物。ERⅠ、BaHⅠ为Prega公司产物。荧光质粒pEGFP/2购自lnteh公司。T4DAN毗连酶为宝生物工程〔大连〕产物。Lipfetaine2000为Invitrgen公司产物。DE造就液为Gib公司产物。金标识表记标帜的羊抗鼠IgG抗体为美国ZYED公司产物。质粒抽提试剂盒为上海博彩生物科技产物。抗人ANGAb由本室制备[7]。脐静脉内皮细胞〔HUVE〕为本室保存。其他生化试剂购自华美生物工程公司等。1.2要领2效果2.1人ANG的真核表达[8]在荧光显微镜下,可见pEGFP/ANG质粒转染的HUVE出现绿色荧光,而未转染的细胞那么不表现荧光(图1)。转染72h后,用SP法免疫组化染色检测ANG基因的表达表现,重组质粒pEGFP/ANG转染的HUVE胞质中布满了棕色颗粒;而空质粒转染的细胞中,细胞全部呈蓝色〔图2〕。2.2ANG在HUVE中的定位〔1〕共聚焦显微镜不雅察:在共聚焦显微镜下,可见ANGGFP交融卵白与HUVE的细胞核区相重叠,与高尔基体及内质网无重叠〔图3〕;而单独的GFP卵白是漫衍于整个细胞的。〔2〕透射电镜不雅察:透射电子显微镜下不雅察,可见HUVE核的核仁区有浓集的金颗粒,在细胞核区的其他部位也有少数散在的金颗粒;而在细胞质及其他细胞器部位均未见金颗粒〔图4〕。图1ANG在HUVE中表达的荧光显微镜不雅察〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG转染的HUVE;B:未转染的HUVE.图2ANG在HUVE中表达的免疫组化〔SP法〕染色检测〔×200〕〔略〕A:pEGFP/ANG转染的HUVE;B:空质粒转染的HUVE.图3表达的ANG在HUVE中定位的共聚焦显微镜不雅察〔×1000〕〔略〕图4表达的ANG在HUVE中定位的透射电镜不雅察〔×60000〕〔略〕3讨论ANG通过与血管内皮细胞外貌的受体结合,可激活胞内的第二信使,诱导细胞进入及构造中新生的管状布局形成〔即新生的血管分支〕等[9,10],从而实现其促进血管生长的作用。血管的形成是构造修复与生长必不成少的紧张环节,因此,ANG的促血管生长作用对构造工程学的生长具有庞大的鞭策作用。已有报道[10],ANG可改进微循环,在血循环较差的半月板纤维软骨的修复,以及在堵塞或损伤的构造中重修侧枝循环等历程中,也发挥着紧张的作用。本研究中,我们以重组质粒pEGFP/ANG转染HUVE后,不雅察了ANG的瞬时表达。由于所用真核表达载体中带有陈诉基因EGFP,因此,在荧光显微镜不雅察下,经重组质粒转染的HUVE中可不雅察到绿色荧光,而未经转染的细胞那么不表现荧光。同时,我们用免疫组化〔SP法〕染色检测表白,pEGFP/ANG重组质粒可以或许在HUVE中表达,为进一步开展ANG基因转移在构造工程学中的应用奠基了必然的基矗透射免疫电镜及共聚焦显微镜不雅察表现,ANG在HUVE中定位于细胞核区,为通过阻断ANG治疗肿瘤的研究提供了必然的实行根据。参考文献:[1]StrydDJ,FettJ,LbbRR,etal.Ainaidsequenefhuanturderivedangigenin[J].Biheistry,1985,24(20):5486-5494.[2]ShiyaaS,YaasakiK,Kaahara,etal.Inreasedseruangigeninnentratininlretalanerisrrelatedithanerprgressin[J].linanerRes,1999,5(5):1125-1130.[3]iyakeH,HaraI,YaanakaK,etal.Inreasedangigeninexpressinintheturtissueandserufurthelialarinapatientsisrelatedtdiseaseprgressinandreurrene[J].aner,1999,86(2):316-324.[4]张宏斌,郭文军,吴锦银,等.肿瘤患者血清血管生长素程度变革的开端研究[J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18〔2〕:190-191.[5]HisaiH,KatJ,Kbune,etal.Inreasedexpressinfangigenininhepatellulararinainrrelatinithturvasularity[J].linanerRes,2022,9(13):4852-4859.[6]ShiyaaS,Kainishi.Angigenininseraasanindependentprgnstifatringastrianer[J].JanerReslinnl,2022,129(4):239-244.[7]张宏斌,江悦华,王捷,等.重组人血管生长素及其单克隆抗体的特性断定[J].细胞与分子免疫学杂志,2001,17(3):277-279.[8]张宏斌,王捷,武婕,等.重组载体pEGFPANG的构建及ANG基因在HUVE中的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2022,20〔1〕:15-17.[9]FlkanJ.Therlefangigenesisinturgrth[J].Se