第五章其他分离方法

第一页，共六十二页，2022年，8月28日第五章其他分离方法纸层析和柱层析法

薄层色谱高效毛细管电泳

超临界流体色谱第二页，共六十二页，2022年，8月28日纸层析第三页，共六十二页，2022年，8月28日一、纸层析分离过程

纸层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。

纸层析流动相的移动是依靠毛细作用。将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。Rf值相差越大，分离效果越好

第四页，共六十二页，2022年，8月28日二、操作技术1.层析纸和层析板特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。第五页，共六十二页，2022年，8月28日2.展开剂由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。第六页，共六十二页，2022年，8月28日3.点样用微量注射器或玻璃毛细管吸取一定量试样点在原点上。试样点的直径一般应小于5mm。可并排点多个试样同时展开。第七页，共六十二页，2022年，8月28日4.显色、检测有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。第八页，共六十二页，2022年，8月28日三、特点及应用

平板色谱简单、方便、及操作费用低，可以在一块层析板上同时展开多个试样及将多条滤纸同时展开。采用方形薄层板还可以方便的进行二维展开，即按一般方法展开后，改变方向和展开剂再次展开，进一步改善分离效果。试样一般不需要经过预处理即可分离。

第九页，共六十二页，2022年，8月28日缺点：分离效率较低，不适用挥发性试样分离。定性定量不便。

应用：平板色谱法在染料、农药、医药、有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经常被使用。也可以用于无机离子的分离。还经常作为高效液相色谱的一种预试方法。第十页，共六十二页，2022年，8月28日柱层析第十一页，共六十二页，2022年，8月28日柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法。

微型柱层析实验第十二页，共六十二页，2022年，8月28日实例:凝胶过滤层析纯化细胞色素C

第十三页，共六十二页，2022年，8月28日一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯化第十四页，共六十二页，2022年，8月28日二、原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。第十五页，共六十二页，2022年，8月28日第十六页，共六十二页，2022年，8月28日优点：a.条件温和b.操作简便c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000第十七页，共六十二页，2022年，8月28日凝胶及柱的选择第十八页，共六十二页，2022年，8月28日凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。第十九页，共六十二页，2022年，8月28日装柱的两种方法：a.手工操作

1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法

第二十页，共六十二页，2022年，8月28日样品上柱分析用量：柱床体积的1—2%制备用量：柱床体积的20—30%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰第二十一页，共六十二页，2022年，8月28日三、试剂与器材试剂：0.01mol/lTris-HCl缓冲液，PH7.5，含0.2mol/lNaCl器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪、记录仪第二十二页，共六十二页，2022年，8月28日（二）装柱

1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。

2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。

第二十三页，共六十二页，2022年，8月28日（四）加样1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。（五）洗脱洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025mol/LTris-HCl，以每管3mL/10min流速洗脱，用自动部分收集器收集流出液。第二十四页，共六十二页，2022年，8月28日第二十五页，共六十二页，2022年，8月28日六、注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。第二十六页，共六十二页，2022年，8月28日薄层层析法（TLC）第二十七页，共六十二页，2022年，8月28日引言历史：薄层层析法TLC：50年代后在纸层析和柱层析的基础上发展起来1951年首先对其进行了系统的研究1958年E.Stahl对薄层层析用的吸附剂和涂层工具进行改进并使之标准化，克服了技术上的困难，使TLC获得迅速发展定义：TLC是把固定相吸附剂铺在玻璃板上铺成均匀的薄层，把试液点在层析板（即薄层）的一端试样中各组分就被吸附剂所吸附，由于薄层的毛细管作用，展开剂沿着吸附薄层上升，试样溶解在展开剂中，在固定相和流动相之间不断的发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。优点：快速，做一次薄层层析只需10-60min；分离效率高；灵敏度可达0.01μg；层析后可用各种方法显色，甚至可喷强腐蚀性的浓硫酸，可高温灼热；应用面广，可以进行定性及定量测定对于各种试剂，可选用不同的吸附剂和展开剂可做吸附层析、分配层析以及离子交换层析。薄层层析法第二十八页，共六十二页，2022年，8月28日原理展开剂在薄层中的流速与展开剂的表面张力、粘度及吸附剂的种类、粒度、均匀度等等因素有关，即和层析系统（固定相和流动相）有关，也和展开距离有关。塔板理论亦可应用于TLC中，将塔板高度和展开距离联系起来。TLC中层析效率同样可用分离度表示。

Rs=2(x2-x1)/(w1+w2)。当Rf=0.33时，Rs值最大，分离最好。选择合适的吸附剂和展开剂是TLC分离能否获得成功的关键。

第二十九页，共六十二页，2022年，8月28日原理吸附剂：最常用的是氧化铝和硅胶。展开剂：可用单一的溶剂并且还常常把各种溶剂按不同比例混合配成混合溶剂以作展开剂。铺层：干法铺层--简单快速、随铺随用，但不能保存，易被吹散。分离效果差。层析展开较快。湿法铺层--常用有倾倒法、刮层法、涂铺器铺层法。点样：需用易于挥发、极性和展开剂相似的溶剂溶解试样以得到

0.5-1%的试液。可用毛细管或微量注射器把试样点成小圆点或长条。力求快速展开：上行法--常用干板近水平方向展开硬板采用近垂直方向展开下行法--比上行法快，但分离效果较差。第三十页，共六十二页，2022年，8月28日SW-86过去的TLC第三十一页，共六十二页，2022年，8月28日7照相

SOP1预制板2点样3

展开4

衍生5检测6

报告8现代平面色谱第三十二页，共六十二页，2022年，8月28日应用1传统中药中糖的分析糖广泛存在于中草药中，干重占整个植物的80-90%中药中多糖的分析在制药上有非常重要的意义TLC可以用来纯化测量和从寡糖、多糖中确认单糖第三十三页，共六十二页，2022年，8月28日应用2低分子量化合物快速成像TLC-MALDI-TOFMS对微量分析展开以及原位操作有高速度和选择性。对于低分子量分析物，基质的背景离子常引起严重的干扰。使用UV吸收质子给体离子液体（Et3N·α-CHCA）作为基质分析低分子量物质如生物碱ArborescidineA、B、C，麻醉剂Levobupivacaine、Mepivacaine和抗体Tetracycline。

第三十四页，共六十二页，2022年，8月28日应用3TLC-MALDI-TOFMS分析粗型脂

多糖LPSs）和LipidA◊内毒素LPSs的混合物，其脂结构域称为LipidA，与多种生物活动相关，没有O链的LPSs称为粗型LPS

◊使用TLC，选用合适的溶剂在硅胶上选择性的萃取分离完整细胞的LPS组分，所得分子物种的谱带在无损伤成像后从板上刮下来直接和基质混合，用MALDI-TOFMS进行分析◊基质加入柠檬酸极大改善谱图

◊TLC直接从细胞中萃取分离出LPSs并进行表征，快速、灵敏，可用于结构和血清分析。第三十五页，共六十二页，2022年，8月28日应用4TLC-VC-MALDIMS分析神经节苷脂神经节苷脂广泛存在于动物细胞外膜表面，代谢、生物合成、生理性质均引起人们注意。其中TLC是分析这类糖脂混合物以及其生物行为的标准工具[17-18]。TLC和MS偶联起来可以满足结构分析使用1-10mbar达到振动冷却（vibrationalcooling）即用TLC-VC-MALDI-FTMS分析神经节苷脂

VeraB.Ivlevaetc.Anal.Chem.2004,76,6484.

◊TLC-VC-MALDI-FTMS联用样品处理简单，可以二维成像◊傅里叶变换有高分辨率和准确度，可以更好的分析结构细节◊外置离子源可规避TLC板的不规则表面引起的分辨率和准确度的降低◊TLC板还可直接与MALDI相连，不需对分析物进行再次萃取。第三十六页，共六十二页，2022年，8月28日5TLC板荧光成像分析神经节苷脂TomohiroHayakawa等人利用100ºC以下仅有唾液酸发荧光的特征，通过荧光成像定量测定神经节苷脂神经节苷脂上唾液酸浓度与荧光强度的线性范围47pM-4.5nMTLC板上的荧光成像分析可以测量更宽范围的神经节苷脂通过调整加热温度，可分析糖脂类物质。该方法简单、低廉、重现性好、不需特殊试剂、不需荧光标记，可以定量测定。

TomohiroHayakawa;MitsuhiroHiraiAnal.Chem.2003,75,6728.

第三十七页，共六十二页，2022年，8月28日进展

解析电喷雾电离（DESI）是新的大气压解析电离方法DESI主要应用于表面分析，TLC可以通过DESI和MS偶联第三十八页，共六十二页，2022年，8月28日总之TLC省时、省原料，可以同时分析多种样品。耗资少，所需仪器少，所需操作培训少，它是一种平面的分离手段，极易和MALDI-MS(基体辅助激光解吸电离质谱法

)联用，甚至可以在原位分析多种物质，也有许多尝试应用不同的电离源来进行结构和定量测定，在许多领域都有潜在的应用前景。第三十九页，共六十二页，2022年，8月28日高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳基本原理二、仪器装置三、影响柱效的因素及改进方法四、主要特点和应用第四十页，共六十二页，2022年，8月28日高效毛细管电泳仪器（1）第四十一页，共六十二页，2022年，8月28日高效毛细管电泳仪器（2）第四十二页，共六十二页，2022年，8月28日高效毛细管电泳仪器（3）第四十三页，共六十二页，2022年，8月28日一、高效毛细管电泳基本原理

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。第四十四页，共六十二页，2022年，8月28日2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。第四十五页，共六十二页，2022年，8月28日3.电泳现象与电渗流现象

电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度ν电泳

电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH>3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。第四十六页，共六十二页，2022年，8月28日4.分离过程

电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。第四十七页，共六十二页，2022年，8月28日5.分离类型八种分离类型(1)

毛细管区带电泳（CZE）

最普遍、最基本的一种分离模式。(2)毛细管凝胶电泳（CGE）

将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。第四十八页，共六十二页，2022年，8月28日(3)毛细管胶束电动色谱（MECC）

在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流>ν电泳，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。第四十九页，共六十二页，2022年，8月28日二、仪器装置电压：0～30KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-19～10-21

mol/L）第五十页，共六十二页，2022年，8月28日三、影响柱效的因素及改进方法热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。第五十一页，共六十二页，2022年，8月28日四、主要特点和应用高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。高灵敏度：可检测出低至10-21

mol/L浓度的物质。高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质.试样用量少：仅需几nL（10-9L）的试样仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：进样不够方便。应用范围相对较窄。分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。第五十二页，共六十二页，2022年，8月28日

超临界流体色谱一、超临界流体色谱的特点与原理featureandprincipleofSFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structureandgeneralprocessofSFC

三、超临界流体色谱的应用applicationofSFCsupercriticalfluidchromatograph,SFC第五十三页，共六十二页，2022年，8月28日Berger(产地：美国)超临界流体色谱仪(SFC)

技术参数

1.流量0--70ml/min

2.改性剂0-100%

3.多阶程序升温

4.压力程序主要特点1.分析速度比HPLC提高3-10倍

2.溶剂成本是HPLC的1/3-1/40

3.可以连接气相的FID检测器,也可连接液相的UV,DAD等检测器，更有MS检测器

4.杰出的手性化合物分离能力

5.精密的超临界流体控制技术第五十四页，共六十二页，2022年，8月28日JASCO(产地：日本)超临界色谱仪(SFC)

技术参数1.流量范围:0.001-10ml/min

2.最高压力:30MPa主要特点

1.与泵一体的泵头制冷装置设计便于操作

2.独有的SSQD系统,确保了被输送介质的流速稳定

3.泵头电子冷却装置保持泵头温度低于－4℃

4.系统控制单元包括各种操作模式,如加入有机改性试剂第五十五页，共六十二页，2022年，8月28日一、超临界流体色谱的特点与原理

principleandcharacterofsupercriticalfluidchromatography1.概述

超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:（1）可处理高沸点、不挥发试样；（2）比LC有更高的柱效和分离效率。第五十六页，共六十二页，2022年，8月2