酶制剂发酵生产

关于酶制剂发酵生产第1页，共69页，2023年，2月20日，星期日酶合成方式：

1958Crick中心法则DNAmRNA酶转录翻译RNA聚合酶第一节酶生物合成调控机制第2页，共69页，2023年，2月20日，星期日转录是以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA的过程。翻译：以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种tRNA，酶和辅助因子的作用，合成多肽的过程。第3页，共69页，2023年，2月20日，星期日一、诱导作用（Induction）

1、概念：某些酶在通常情况下生物体不能合成或合成很少，但加入“诱导物”后，就能大量合成，这种现象称为诱导。第4页，共69页，2023年，2月20日，星期日

LaczLacyLaca

20世纪60年代初法国巴斯德研究所F.JacobandJ.Monod“乳糖操纵子假说”乳糖酶第5页，共69页，2023年，2月20日，星期日（1）决定酶合成有两个不同的基因群。2、乳糖操纵子假说第6页，共69页，2023年，2月20日，星期日决定酶合成的两个基因群操纵子（operon）调节基因R(Regulatorygene)启动基因P

操纵基因O结构基因SP:PromotorO:OperatorS:Structure第7页，共69页，2023年，2月20日，星期日SPLaczLacyLacaOR调节基因操纵基因启动基因结构基因Operon操纵子DNA第8页，共69页，2023年，2月20日，星期日

①调节基因（Regulatorygene）：

可产生阻遏蛋白，阻遏蛋白能与操纵基因结合。R阻遏蛋白SPLaczLacyLacaORDNA第9页，共69页，2023年，2月20日，星期日②启动基因（Promotor）：是RNA聚合酶的结合部位和转录起点。RNA聚合酶SPLaczLacyLacaORDNA第10页，共69页，2023年，2月20日，星期日

③结构基因（Structure）：

是DNA模板，在RNA聚合酶作用下，根据其碱基序列转录出mRNA。SPLaczLacyLacaORDNAmRNAzmRNAymRNAa转录翻译酶RNA聚合酶第11页，共69页，2023年，2月20日，星期日

④操纵基因（Operator）：位于启动基因和结构基因之间的一段碱基序列，是阻遏蛋白的结合位点。在操纵子中起“开关”作用。SPLaczLacyLacaORDNA第12页，共69页，2023年，2月20日，星期日调节基因操纵基因SPLaczLacyLaca

阻遏蛋白（有活性）转录启动基因ORA、无诱导物（乳糖）存在

结构基因RNA聚合酶翻译酶mRNA（2）乳糖酶合成调控方式第13页，共69页，2023年，2月20日，星期日mRNAZmRNAYmRNAA

阻遏蛋白(无活性)乳糖

阻遏蛋白(有活性)调节基因操纵基因SPLaczLacyLaca启动基因R结构基因RNA聚合酶B、有诱导物（乳糖）存在O转录翻译酶第14页，共69页，2023年，2月20日，星期日Question：

以上理论对指导酶制剂生产有何实际意义？第15页，共69页，2023年，2月20日，星期日3、乳糖操纵子假说对指导

酶制剂生产的意义在酶合成时添加诱导物底物关键：选择合适的诱导物和其浓度底物的结构类似物实验确定第16页，共69页，2023年，2月20日，星期日生产实例：酵母生产β-半乳糖苷酶以葡萄糖作唯一碳源培养酵母菌以乳糖作为唯一碳源培养酵母菌几分钟后β-半乳糖苷酶乳糖最佳诱导浓度：120g/L第17页，共69页，2023年，2月20日，星期日意义2：利用现代诱变育种技术使基因发生突变①

使调节基因R发生突变②使操纵基因O发生突变第18页，共69页，2023年，2月20日，星期日mRNAzmRNAymRNAa转录翻译酶RNA聚合酶R①

调节基因R突变

利用现代育种技术，使调节基因发生突变，致使其不能产生阻遏蛋白，使诱导酶变成组成酶。

阻遏蛋白PLaczLacyLacaOS第19页，共69页，2023年，2月20日，星期日mRNAZmRNAYmRNAa转录翻译酶RNA聚合酶②

操纵基因O突变

利用现代育种技术，使操纵基因发生突变，使其不与阻遏蛋白作用，使诱导酶变成组成酶。

阻遏蛋白(有活性)PLaczLacyLacaRSO第20页，共69页，2023年，2月20日，星期日二、酶合成的反馈阻遏Repression反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用第21页，共69页，2023年，2月20日，星期日阻遏蛋白操纵基因结构基因调节基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。酶代谢产物一旦大量积累阻遏蛋白被产物激活，结构基因不表达。第22页，共69页，2023年，2月20日，星期日这一理论在实践意义：(1)设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈阻遏。第23页，共69页，2023年，2月20日，星期日三、酶合成的分解代谢阻遏作用又称葡萄糖效应是指微生物在其培养基中由于葡萄糖的存在虽然能迅速生长，但明显地抑制某些分解代谢诱导酶的形成。第24页，共69页，2023年，2月20日，星期日

将E.coli培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基上，出现“二峰生长现象”即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗尽之后诱导形成-半乳糖苷酶葡萄糖分解产物对-半乳糖苷酶形成阻遏第25页，共69页，2023年，2月20日，星期日葡萄糖过量存在——放出的能量部分储存在ATP中ADP+AMP——ATPcAMP+H2OAMPcAMP-CRP复合物的浓度降低启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合RNA聚合酶无法结合到启动基因酶的生物合成无法进行。磷酸二酯酶第26页，共69页，2023年，2月20日，星期日酶微生物引起阻遏作用物质α-淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌果糖纤维素酶绿色木霉葡萄糖、甘油、纤维二糖蛋白酶巨大芽孢杆菌葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶二孢内孢酶麦芽糖、葡萄糖、甘油分解代谢阻遏实例第27页，共69页，2023年，2月20日，星期日用甘油代替果糖培养嗜热脂肪芽孢杆菌，α-淀粉酶产量可提高25倍。采用甘露糖作为荧光假单胞杆菌培养基时，纤维素酶的产量比用半乳糖作为培养基时要高1500倍以上。如果微生物需要某些代谢阻遏物作为碳源，在工业生产中则可采用限量流加碳源的办法，便可减少或避免这种阻遏作用。第28页，共69页，2023年，2月20日，星期日第二节产酶微生物的筛选

动物酶植物微生物微生物易于大量培养，倍增时间短；DNA技术使微生物生产特殊作用的酶，并大大提高产量；因此，微生物可以说是酶商业化生产的最佳来源。第29页，共69页，2023年，2月20日，星期日1、产酶菌的分布规律为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可以从该物质比较丰富的地方寻找。

Exp.豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物；处理降解合成物质的产酶菌则往往能在污水处理处获得；第30页，共69页，2023年，2月20日，星期日生产性能鉴定主要通过初筛和复筛确定。初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目标酶的菌株，要求检出方法快捷、简便初筛多选用平板培养透明圈法2、菌种生产性能鉴定第31页，共69页，2023年，2月20日，星期日第32页，共69页，2023年，2月20日，星期日细胞外的水解酶1、溶解度——不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等培养基中生长——透明圈大小2、酸碱度——酸碱指示剂——变色圈大小和颜色3、颜色——合成特定底物与酶反应变色——变色深浅第33页，共69页，2023年，2月20日，星期日第34页，共69页，2023年，2月20日，星期日复筛是在初筛的基础上筛选产酶量高，性能更符合要求的菌株，要求测定方法准确可靠。复筛多采用摇瓶培养的方法。将初筛出来的菌种移入三角瓶振荡培养，对产物进行分析检定，找出产酶量最高，性能符合要求的菌株。第35页，共69页，2023年，2月20日，星期日第三节酶的液体深层发酵法液体深层发酵是现代普遍采用的方法，主要设备发酵罐是一个具有搅拌浆和通气系统的密闭容器。国内多采用10-50t，国外多用100t以上。第36页，共69页，2023年，2月20日，星期日第37页，共69页，2023年，2月20日，星期日第38页，共69页，2023年，2月20日，星期日第39页，共69页，2023年，2月20日，星期日第40页，共69页，2023年，2月20日，星期日第41页，共69页，2023年，2月20日，星期日第42页，共69页，2023年，2月20日，星期日第43页，共69页，2023年，2月20日，星期日第44页，共69页，2023年，2月20日，星期日第45页，共69页，2023年，2月20日，星期日第46页，共69页，2023年，2月20日，星期日液体发酵流程图实验室种子制备阶段（一级种子培养）生产车间种子制备阶段（二级种子培养、三级种子培养）二级发酵三级发酵沙土孢子冷冻干燥孢子斜面孢子摇瓶液体培养固体培养基培养一级种子罐二级种子罐发酵罐第47页，共69页，2023年，2月20日，星期日空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵碳源、氮源、无机盐等营养物质灭菌

酶分离纯化成品（液体或颗粒）控制t、pH、DO、泡沫、补料等第48页，共69页，2023年，2月20日，星期日发酵罐发酵全过程动画.exe第49页，共69页，2023年，2月20日，星期日（1）温度的调节控制

Exp.不同的细胞有各自不同的最适生长温度。如：枯草杆菌最适生长温度34～37℃，黑曲霉28～32℃，植物细胞25℃左右。第50页，共69页，2023年，2月20日，星期日温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。第51页，共69页，2023年，2月20日，星期日（2）pH的变化与控制培养基的pH值与细胞的生长繁殖以及发酵产酶都有密切关系。细胞发酵产酶的最适pH值通常接近于该酶反应的最适pH值。例如：发酵生产碱性蛋白酶的最适pH值为碱性(pH8.5～9.0)；而酸性(pH4.0～6.0)条件有利于酸性蛋白酶的产生。

第52页，共69页，2023年，2月20日，星期日有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。

Exp.黑曲霉可既生产α-淀粉酶，又可生产糖化酶。

pH值中性——α-淀粉酶增加糖化酶减少；

pH值酸性——糖化酶增加α-淀粉酶减少。第53页，共69页，2023年，2月20日，星期日pH的调节可以通过改变培养基的组分或比例来实现，必要时可以使用缓冲溶液，或流加适宜的酸、碱溶液，以调控培养基的pH变化。第54页，共69页，2023年，2月20日，星期日（3）溶解氧的调节控制大多数的产酶菌是好气菌，调节通气量对产酶意义重大。一般细胞只能利用溶解在培养基中的氧气——溶解氧。液体发酵较小的通气量有助于霉菌的生长，较大的通气量有助于产酶。第55页，共69页，2023年，2月20日，星期日（4）泡沫形成与控制泡沫是如何形成的？通气,搅拌；发酵液中含有蛋白质、糖和脂肪等.第56页，共69页，2023年，2月20日，星期日泡沫的危害有哪些大量逃液增加污菌机会使部分菌体黏附在罐盖或罐壁上失去作用泡沫严重时还会影响通气搅拌的正常进行，防碍菌的呼吸，导致产量下降

第57页，共69页，2023年，2月20日，星期日机械消泡机械消泡是一种物理作用，它是靠机械强烈振动和压力的变化，促使气泡破裂，或借助于机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。第58页，共69页，2023年，2月20日，星期日罐内消泡——耙式消泡桨第59页，共69页，2023年，2月20日，星期日化学消泡——消泡剂天然油脂玉米油、米糠油、豆油、棉子油、菜子油和鱼油、猪油等。已有逐渐被合成消沫剂取代的趋势。高碳醇和酯类十八醇第60页，共69页，2023年，2月20日，星期日聚醚类聚氧丙稀甘油和聚乙烯氧丙稀甘油（泡敌）硅酮类聚二甲基硅氧烷与其衍生物。第61页，共69页，2023年，2月20日，星期日（6）空气灭菌介质过滤除菌让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物，而去的无菌空气的方法，目前工业除菌几乎均采用该方法。常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。第62页，共69页，2023年，2月20日，星期日第四节提高酶产量的方法一、通过条件控制提高酶产量1141、添加诱导物适用：诱导酶类，效果十分显著。关键：选择诱导物及诱导浓度诱导物种类：底物类似物；底物或诱导物前体或衍生物；NOTICE：诱导与阻遏无明显界限，关键在于浓度选择诱导物浓度对酶诱导形成速率有一定影响。诱导潜伏期第63页，共69页，2023年，2月20日，星期日2、降低阻遏物浓度分解代谢引起：适宜的碳源种类很重要

Exp.甘露糖作为碳源生产纤维素酶比使用半乳糖酶活力提