微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用(简)徐 伟 东

微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一当前1页，总共89页。一、背景介绍在1993-1998年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召回案件达到1370件，占所有产品召回案件的36%我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到微生物污染我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是2010年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。当前2页，总共89页。对微生物分类水平较低，只能鉴定到“属”，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限当前3页，总共89页。分子方法分子生物学技术研究的是微生物DNA序列信息，常用于细菌分类的16SrDNA也有1500个碱基，每个碱基位置由ATGC四种核苷酸中的一种组成，多样性可达种可能（约）10900。新版的《伯杰氏系统细菌学手册》微生物DNA变异信息为主传统方法人类已知的土壤微生物已达到10万种现在常用的微生物鉴定用生化反应只有20多种，实际经过研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅2000多种。微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统——仅能鉴定550种细菌通过碳源利用进行微生物鉴定的Biolog系统也仅能鉴定2000种微生物当前4页，总共89页。

微生物变异能力强，生化反应准确度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限当前5页，总共89页。生化反应鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属”微生物的酶系统基本相同，可以达到鉴定的目的微生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，导致鉴定失败在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反应才会被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反应的微生物则被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、社区食物中毒的重要污染源。当前6页，总共89页。不能对微生物污染进行准确溯源分析传统微生物鉴定方法的局限当前7页，总共89页。在进化过程中生物DNA分子会形成大量DNA多态性区域和非编码DNA序列。不会造成生物种属归类争议也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是微生物种内差异的来源当前8页，总共89页。如常用于真菌种类鉴定的ITS基因ITS片段能保持相对稳定的变异频率亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征当前9页，总共89页。微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一当前10页，总共89页。2.1技术手段2.2方法比较当前11页，总共89页。2.1技术手段2.2方法比较当前12页，总共89页。革兰氏染色镜鉴按照标准进行传统的生化反应鉴定API试剂条菌鉴定国际金标准

半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）

全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定手段MiniVIDAS筛选系统免疫凝集/免疫沉淀实验微生物检测手段荧光定量PCR(BAX)色谱、光谱分析技术分子生物学技术传统筛选方法2.1技术手段当前13页，总共89页。GenBankPCR基因分型分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定1234当前14页，总共89页。1.形态学鉴定3.核糖体水平上的鉴定APIVITEK16SrDNA序列分析分子杂交（DupontRiboPrinter）2.生化鉴定傅里叶红外光谱Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因组水平上的鉴定5.脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序列分析(MLST),多位点重复串联序列分析(MLVA),随机扩增多态性分析技术（RAPD)当前15页，总共89页。API试剂条——菌鉴定国际金标准无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。特点：完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种简单方便：标准化方法，成本低廉，判读结果简单快速结果：4-24小时。当前16页，总共89页。半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G（-）杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。当前17页，总共89页。原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养4小时/24小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的2个参数（鉴定百分率及T-值）计算鉴定结果特点：速度快捷ATBExpression提供自动化接种，阅读及分析试条结果。准确可靠的结果ID32及快速ID32试条由金牌标准API试条改良而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统当前18页，总共89页。全自动细菌鉴定仪（VITEK2）检测项目：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，70多种药物约50多种药物组合的药敏卡。当前19页，总共89页。原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反应。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定。特点：快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等)鉴定可提前到2小时。操作简便：全部操作自动化，简单而方便资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室资料获得AOAC国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的当前20页，总共89页。全自动荧光免疫分析仪(mini-VIDAS)

检测项目：食品及环境中最常见致病性细菌（李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠杆菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测）的快速筛检。当前21页，总共89页。原理：

以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（ELFA）。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。特点：结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美国FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。可同时进行12个相同或不同的测试。每天进行约60—80项测试特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染全自动化、操作简便当前22页，总共89页。荧光定量PCR聚合酶链式反应技术（PCR）是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物DNA分子进行数百万倍放大的新型检测技术。荧光定量PCR技术在普通PCR技术基础上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰因素，克服了普通PCR易污染的问题，除去样品前增菌时间，5小时内可得到检测结果。微生物检测限可能达到1CFU/mL以下，而且抗杂菌干扰能力强当前23页，总共89页。DNA测序技术DNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息如细菌的16SrDNA和真菌的ITS序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于DNA测序方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来越广泛的应用当前24页，总共89页。a)微生物污染溯源分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标准方法现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的研究中显示出广泛的应用前景

b)相似微生物DNA序列比对和微生物进化分析根据生物DNA序列的特异性分析，可检测生物基因的微小变化，监控和预测微生物污染的爆发16SrDNA分型已被广泛认可，微生物16SrDNA进化树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范围宽，发展前景广，发展潜力巨大当前25页，总共89页。指纹图谱技术分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行酶消化，通过特异性探针与目标DNA序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。现有成熟的基于16SrDNA的分子杂技图谱库涵盖了200个属的1200多种6950株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体和任何细菌建立了一个全自动的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微生物环境进行控制及流行病学调查等强大功能。当前26页，总共89页。a)近红外傅立叶光谱分析b)色谱分析物质成分分析当前27页，总共89页。红外傅立叶光谱分析FT-IR技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差别德国Bruker公司微生物FT-IR分析用户手册主要采用1200-900ｃｍ-1，3000-2800ｃｍ-1，1500-1400ｃｍ-1谱段组合进行微生物判别分析，这3个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。当前28页，总共89页。色谱分析微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径高效液相色谱(High-performanceliquidchromatography，HPLC)气相色谱(Gaschromatography，GC)气相色谱质谱联用(Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向当前29页，总共89页。2.1技术手段2.2方法比较当前30页，总共89页。各种鉴定方法的比较我所抗生素室通过比较分析近百种微生物的生化鉴定方法（API和VITEK2鉴定）和分子生物学方法鉴定方法，客观准确的多方面评价各种方法的优劣当前31页，总共89页。微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一当前32页，总共89页。3.1细菌鉴定3.2溯源分析当前33页，总共89页。3.1细菌鉴定3.2溯源分析当前34页，总共89页。3.1细菌鉴定3.2溯源分析当前35页，总共89页。微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一当前36页，总共89页。四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4当前37页，总共89页。四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4当前38页，总共89页。微生物检测实验室应首先确保实验室的设施和环境不会对检验过程带来微生物污染只有排除检测过程中的微生物污染，才能保证检验结果的准确性，才能有足够的理由相信，样品污染来自药品本身，而不在检验过程中被污染的对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样品检测更加重要四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

当前39页，总共89页。公正准确科学高效当前40页，总共89页。加强检测的“过程控制”建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。如果样品检验过程中不合格，分离鉴定样品中的微生物，与环境微生物数据库比较、分析微生物污染来源，出具客观的检测报告，杜绝实验结果假阳性和假阴性的发生当前41页，总共89页。样品接收样品摆放样品分发环境设施仪器实验过程结果报告①登记样品名称，检查是否具有唯一性标识，并检查是否与运转表内容一致②看样品外包装是否完整、密封,是否能保持无菌状态符合检验要求③样品数量是否符合检验要求样品接收原始记录原始记录审核检测过程控制当前42页，总共89页。样品分发环境设施仪器实验过程结果报告①根据样品的贮存条件进行冷藏、冷冻或常温放置②将样品分区域（在检、待检、检毕）摆置③冰箱和冰柜的温度记录样品摆放样品摆放样品接收原始记录原始记录审核检测过程控制当前43页，总共89页。环境设施仪器实验过程结果报告①环境和设施等的质量管理②仪器状态是否正常（是否在计量标志的有效期内）③做好仪器使用记录仪器设施环境样品接收样品摆放样品分发原始记录原始记录审核检测过程控制当前44页，总共89页。样品分发环境设施仪器实验过程结果报告核对质量标准是否现行有效培养基的质量评估工作的审查关键步骤用试剂的质量控制阳性对照菌的管理留样管理废弃物管理对灭菌效果评价的审查实验过程质量控制管理（人员技术能力，方法比对实验，人员比对实验，制备质控样品加菌随行检查）应急事件处理程序实验过程样品接收样品摆放原始记录原始记录审核检测过程控制当前45页，总共89页。样品分发环境设施仪器实验过程结果报告①完全按SOP书写，所写即所做的内容②统一原始记录的格式和内容③按既定期限完成原始记录的书写④按不同来源分别输入结果原始记录样品接收样品摆放原始记录原始记录审核检测过程控制当前46页，总共89页。样品分发环境设施仪器实验过程结果报告①原始记录的完整性②检验数据的正确性③结果判断的合理性原始记录审核样品接收样品摆放原始记录审核原始记录检测过程控制当前47页，总共89页。样品分发环境设施仪器实验过程结果报告阴性结果直接报告阳性结果→鉴定结果报告样品接收样品摆放原始记录原始记录审核检测过程控制当前48页，总共89页。建立环境微生物菌株信息库实验室洁净环境微生物监控当前49页，总共89页。头状葡萄球菌（Staphylococcus

capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcus

haemolyticus）缓症链球菌（Streptococcus

mitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcus

cohnii）藤黄微球菌（Micrococcus

luteus）常见洁净环境微生物污染当前50页，总共89页。

实验室洁净环境微生物监控建立实验室洁净区采样方案《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》（GB/T16292~16294—1996）《药品生产质量管理规范》（1998）以一个月为周期，连续监测实验室环境不定期对无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种群和分布数据检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、表面微生物检测和操作人员卫生检测等当前51页，总共89页。在实验环境中以葡萄球菌属（Staphylococcus）分离数目最多为34%微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）次之，分别为19.15%和17.04%假单胞菌属（Micrococcus）、莫拉菌群（Moraxella）、短波单胞菌属（Brevundimonas）占4.26%短杆菌属（Brevibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、泛菌属（Pantoea）等所占比例归于其他项中收集的环境微生物中酵母菌占8.51%，主要为近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis）和粘红酵母（Rhodotorulamucilaginosa）霉菌等丝状真菌占4.26%，主要为青霉菌属我所实验室洁净环境微生物监控当前52页，总共89页。当前53页，总共89页。

我所环境微生物菌株信息库的建立我们连续三个月对实验室洁净环境中部分环境微生物进行追踪，并进行同源性分析当前54页，总共89页。以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到16株葡萄球球菌属细菌。7、8月分别收集到的细菌239与250和232与246之间同源性较高，归在一个子类中，属于同源污染。说明7月和8月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒漏洞。经过消毒，在9月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未发现有和前两月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，9月份收集到的部分葡萄球菌为新进入环境的微生物。当前55页，总共89页。同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度重视仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染的作用要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全面调查建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。当前56页，总共89页。微生物进行鉴定菌株来源共241株当前57页，总共89页。四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4当前58页，总共89页。

在药品微生物检验中的应用在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复合和监控。通过对比环境监测的微生物种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增菌检验报告的含金量。当前59页，总共89页。在细菌污染检查中的应用当前60页，总共89页。分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16SrDNA

序列16SrDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色API鉴定形态鉴定生化鉴定VITEK鉴定细菌的鉴定流程图

当前61页，总共89页。在真菌污染检查中的应用当前62页，总共89页。

在真菌污染检查中的应用现行国标仅能够对曲霉属，青霉属，镰刀菌属等少数几个种属的霉菌进行鉴定。我国的食品卫生微生物学检验国家标准中，对于青霉菌的鉴定需要在分离纯化后培养12-14天，再对其孢子及菌丝进行形态学观察。真菌孢子易于在空气中飘散，难以杀灭，对实验室环境和检验人员安全具有潜在污染风险。分子生物学鉴定技术有效的解决了区分污染来源的问题。该方法不需要使用选择性培养基，纯化后即可进行菌种鉴定。对真菌的菌丝体和孢子均能够进行DNA的提取，避免霉菌产生的大量孢子对实验室工作环境带来的潜在污染危害当前63页，总共89页。真菌的鉴定流程图分离纯化得到真菌样品的单菌落真菌菌落形态观察真菌DNA的提取构建系统发育树分子生物学评价通用引物扩增真菌ITS序列ITS序列在GenBank中进行Blast分析鉴定结论当前64页，总共89页。四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4当前65页，总共89页。美国FDA在要求药厂将微生物鉴定到“种”一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控对药厂生产环境监管和风险评估上应用当前66页，总共89页。上海某药业产品受微生物潜在污染风险上海某药业有限公司无菌产品微生物污染溯源某医疗器材有限公司灭菌方法研究对药厂生产环境监管和风险评估上应用当前67页，总共89页。某制药厂沉降菌同源性分析当前68页，总共89页。当前69页，总共89页。检测实验室微生物信息库制药企业微生物信息库同源性分析比对污染源是否微生物鉴定技术平台建设的意义及运用鉴定当前70页，总共89页。四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用

增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4当前71页，总共89页。4.4应用范围广，扩展能力强，可进行产品真伪鉴别和致敏原检测国际上普遍加强了有关食品标签的法律法规，对相关标准不断细化。越来越多国家和地区开始全面实施对食品致敏原成分加以标识的规定酶联免疫技术PCR技术等动植物产品的真伪鉴定追踪产品产地鉴别产品主要组成成分PCR技术在致敏原检测中具有较高的检出率，能检测样品中ppm级的致敏原物质当前72页，总共89页。微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一当前73页，总共89页。企业自查政府监管微生物样本的采集微生物菌株鉴定企业环境控制及污染溯源能力新型监管模式的建立构建微生物分布图建立菌种信息库

A类企业：分子水平B类企业：生化水平C类企业：境检、API水平企业－－微生物鉴定到“属”药检所－－－鉴定到“种”

“菌珠”五、上海医药企业微生物污染的监督、管理和风险评估新模式的建立－－－新的监管模式流程图当前74页，总共89页。

新的监管模式流程图食品药品监督管理局科学规划企业内部自查局各职能部门外部督察药检所强大的技术支撑

上海医药企业微生物污染的信息库监督、管理和风险评估当前75页，总共89页。完善对制药企业的风险分级监管建立和健全日常监督检查方法强化企业微生物风险管理意识建立药品污染源通报、追踪平台，完善药品召回机制5.15.25.35.4帮助企业改进产品质量，打造医药安全公共研发平台5.5五、上海医药企业微生物污染的监督、管理和风险评估新模式的建立当前76页，总共89页。5.1完善对制药企业的风险分级监管对制药企业分级管理往往依据药品的产量、使用频次及以往的污染事件严重性，对生产工艺和生产环境缺乏有效的数据监测，容易忽略潜在的微生物污染危害要是对文件资料的审查和经验性的对加工条件和过程的评判，缺乏对微生物污染进行监控和调查的手段，仅能对生产环境和终产品的细菌总数和控制菌进行检查，缺乏量化的评价指标检测机构对微生物检测和追踪识别能力大幅提高通过采用微生物鉴定和分型技术对药品加工全过程的监控，能对微生物污染来源进行详细的分析，绘制工厂微生物分布图，了解工厂生产过程中的污染重灾区和引起污染的工艺步骤为建立更全面的药品质量体系和风险管理体系提供了有效的分析手段。增强了监管部门对制药企业的监管力度和检查能力传统监管方法新监管方法当前77页，总共89页。上海共有制药企业约200家上海地区被列为重点监控对象的注射剂、生物制品和特殊药品三类高风险品种的生产企业仅有58家将临时性的整顿深化为常态性的管理，可以使监管部门快速应对微生物性污染突发事件，为有效评估污染源的危害和范围提供详尽的第一手分析资料这些品种涉及范围广、产品使用频繁，且容易发生微生物性药品污染事件。逐步提高上海地区制药企业的微生物性污染的风险管理水平。当前78页，总共89页。上海地区高危企业微生物污染监管方式的思考

1、调研：掌握企业生产管理水平和微生物风险管理能力

企业基本情况调查

微生物污染情况现场调查

企业微生物风险管理水平等级划分

制订适合处于不同风险理水平制药企业管理措施和改进意见

2、完善药品微生物污染风险管理体系，制定切实可行的日常微生物监控网和风险防范、预警机制。

对制药企业微生物污染的控制相关从业人员进行有计划的指导和培训

为各类企业设定微生物风险控制水平目标，帮助企业建立微生物自查、预警和防护体系

建设微生物污染监控数据库，为药品监管部门提供监管依据，建立药品安全监管长效机制当前79页，总共89页。对有条件的A类企业：要具备一定的分子生物学鉴定方法和完备的生化鉴定手段，能对环境微生物给出基本准确度鉴定结果；对B类企业：要具备完善的生化鉴定体系，要能给出可靠的微生物生化谱；对C类企业：基本要具有API试剂条鉴定条件和形态分析能力。

逐步规范企业生产行为，将风险预警步骤前移至企业日常生产过程，并设立考核指标和文件记录体制，对监管部门常规检查提供资料和考核标准。当前80页，总共89页。5.2建立和健全日常监督检查方法覆盖从原料到终产品的全过程监控对空气采样共设置16个采样点，同时增设表面微生物采样点表面细菌的测定采用平板接触法，包括房间的门把手、操作人员操作服胸口和前臂处、手套、口罩、拖鞋底等微生物随着操作人员更容易进洁净环境，最可能成为污染的主要来源当前81页，总共89页。现阶段微生物检验技术突飞猛进，许多先进的检测方法经过了实践和时间的检验，已经具备了普及的条件在中国，许多技术已经被国家标准吸收和引进，如