细胞因子检测(干货分享)

细胞因子检测一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎要作用。某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达其其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量株(即靶细胞)的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA的合成或株(即靶细胞)的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA的合成或原位杂交和PCR等.通过检测细胞内细胞因子的基因组成或法、D10G4。1细胞增殖法及L929细胞增殖法等。IL1，或用P388D1(鼠),THP—1(人)细胞株制备IL－1。本4、将腹腔细胞用含10％小牛血清的RPMI－1640液(10%NBS-RPMI－1640)配成2×106/ml,加到24孔平底培S(二)L929细胞增殖MTT比色法omide,MTT)在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成兰黑色的MTT－甲，形成MTT—甲的量与细胞增殖程度n6、将微量测定板置室温数分钟，保证转变的底物结晶被溶解.D(三)注意事项2、培养器皿和研磨条件:24孔培养板培养细胞活率较高，但生二、TNF的检测(免疫学测定法，双抗体ELISA夹心法)(一)原理选用两种针对rHuTNF－α分子不同表位的单克隆(二)材料和试剂ml4、阴性对照液(未免疫鼠Ig).6、96孔ELISA板.8、包被缓冲液:0.05mol/L，pH9。6Na2CO3—NaHCO312、3％H2O2。13、血清、枸缘酸盐或EDTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养14、ELISA读数仪等。(三)操作步骤ngmlngmlngml5pg/ml、312pg/ml、5、ELISA读数仪测410nm处OD值,绘制标准曲线。2、标本在2~8℃可储存3天,超过3天应放入-20℃或－7℃，避免反复冻融．4、叠氮钠(NaN3)对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用,在本实验系统中应避免使用.1。0。15mol／L，pH7。4PBSKH2PO40。2gNa2HPO4·12H2O2。9gNaCl8。0gKCl0．2g双蒸水加至100mlNa2CO31。59gNaHCO32。93gTween200。5ml洗涤液100mlPEG(聚乙二醇，MW6000)2。0gNa2HPO4·12H2O1。79g6.ABS显色液ABTS5mg底物缓冲液10ml3％H2O220μl细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和mRNA表达的检RNA的测定(斑点杂交法)。将RNA变性后直接点样于硝酸故很适合于临床应用。亦可用于DNA的检测。但其缺点是不能(一)主要试剂No．117)3．DNA片段提取试剂盒：(LaJolla)10mmol／LTris.Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8．0)(2)溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖25mmol／LTris。Cl(pH8。0)10mmol/LEDTA(pH8。0)(3)溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀min8。5ml(5)含相应抗生素的LB培养基(7)溶菌酶(10mg/ml，溶于10mmol／LTris．ClpH(8)无水乙醇(部分—20℃预冷).异丙醇。75%乙醇(部分(9)TE缓冲液(pH8。0)(10)5mol/LLiCl1.5ml(11)RNA酶，RPMI-1640,胎牛血清(FCS),ConA(刀豆蛋白A)等(13)3mol／LNaAc、饱和酚、氯仿:异戊醇(24：1)(二)主要仪器(三)IL—2质粒DNA探针的大量制备取含IL－2质粒DNA的单个菌落置两个25mlLB培养基(含100μg/mlAmp)↓37℃150r/min振摇4h菌液倒入300ml离心管中离心弃上清，加5ml溶液Ⅰ(冰预冷)悬浮细菌，加1ml新配制(pH8．0)的溶菌酶(10mg/ml)心用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),倒出乙醇，倒置吸用1。5mlTE(pH8.0)将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5MLiC用500μlTE(pH8．0)溶解DNA沉淀,移至新EP管中，加加等体积(500μl)含13％(W/V)PEG(800)的1。6mol/LNaCl，充分混合↓4℃12000r／min×5min离心吸去上清，用400μlTE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀加等体积饱和酚(400μl)混合吸上层水相移至另一EP管，加等体积氯仿：异戊醇(24：1)(pH5。2)和2体积的－20℃预冷的无水乙醇，混匀(可见沉淀次↓4℃12000r／min×5min离心去上清↓0.7％琼脂凝胶电泳，确定有质粒DNA后，用XhoIDW38μl3．用WizardTMPCR纯化试剂盒回收IL—2DNA片段2)紫外灯下切下IL—2DNA片段，挑出凝胶到EP管中，加mlResinDNAmix转移到WizardT(四)用DNA标记和检测试剂盒对IL—2探针进行地高辛标记出售的地高辛精标记核苷酸有dig－UTP，dig—dUTP,和dig-ddUTP，它们分别适用于RNA探针，DNA探针和寡核苷高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的A1.、将DNA(1μg~3μg)加热95℃(或100℃)10min，随鲜变性DNA;②2μl六聚核苷混合物(试剂5)；③2μldNTP(五)培养细胞RNA的提取(采用Trizol试剂盒提取RNA)3、于2~8℃离心14600r/min×15min,上层无色水相 RNA的溶解，用20μlDEPC处理的双蒸水溶解RNA沉淀。RNA斑点杂交1、RNA变性:20μlRNA溶液(2μgRNA)40μl100％甲酰胺SCh3、滤器的处理及点样:用0。1NNaOH浸泡(洗)多孔过滤加4、取出膜,80℃烤2~3h，膜保存于-20℃H2O至1000ml1NNaOH约0.5ml(1)预杂交2)先将预杂交液热至60℃。3)将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋，4)尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，将其置60℃1)杂交液(DIGEasyHyb(20ml/100cm2)预温轻振荡30min2)将标记探针DNA(5~25ng/ml)煮沸变性5min，迅速置冰水3)加入到预温的DIGEasyHyb(2。5ml/100cm2)中混合,4)然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/DIGEasyHyb15min。(七)免疫测定3、抗地高辛—AP复合物(75mU/ml)用封闭缓冲液(1×)1∶10000稀释，(八)图象分析结果用MPIAS—500多煤体彩色图文分