现代抗体技术和其应用专家讲座

高慧.11当代抗体技术及其应用现代抗体技术和其应用第1页抗体（antibody,Ab)是B细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生一个蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与对应抗原特异性地结合，含有免疫功效。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指含有抗体活性或化学结构与抗体相同球蛋白抗体和免疫球蛋白关系

抗体都是免疫球蛋白，并非全部免疫球蛋白都含有抗体活性。现代抗体技术和其应用第2页现代抗体技术和其应用第3页免疫球蛋白基本结构

四肽构

，链间二硫键连接两条重链链结（H）和两条轻链（L）氨基端和羧基端。

现代抗体技术和其应用第4页

1.重链与轻链(1)依据重链分类：依据重链靠近羧基末端氨基酸组成及排列次序不一样，将重链分为种：γ、α、μ、δ、ε依据重链组成不一样，将Ig分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE(2)依据轻链分型：κ、λ型现代抗体技术和其应用第5页2.可变区与恒定区依据氨基酸排列次序不一样分为可变区（V）和恒定区（C）可变区（V区）：氨基酸组成、排列次序改变较大恒定区（C区）：氨基酸数量、种类、排列次序及含糖量都比较稳定现代抗体技术和其应用第6页抗原抗体结合

抗原抗体反应可分为两个阶段：第一阶段为抗原与抗体发生特异性结合阶段，此阶段反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应；第二阶段为可见反应阶段，这一阶段抗原抗体复合物在适当温度、pH、电解质和补体影响下，出现沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合介导肉眼可见反应，此阶段反应慢，往往需要数分钟至数小时。在血清学反应中，以上两阶段往往不能严格分开，往往受反应条件（如温度、pH、电解质、抗原抗体百分比等）影响。

抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇和抗体超变区分子间结构互补性与亲和性。这种特征是由抗原、抗体分子空间构型所决定。除二者分子构型高度互补外，抗原表位和抗体超变区必须亲密接触，才有足够结协力。现代抗体技术和其应用第7页抗原抗体结协力抗原抗体是一个非共价结合，不形成共价键

1.静电引力：是因抗原、抗体带有相反电荷氨基与羧基基团间相互吸引能力。2.范德华引力：是抗原、抗体两个大分子外层轨道上电子相互作用时，二者电子云中偶极摆动而产生引力。这种引力能量小于静电引力；

3.氢键结协力：是供氢体上氢原子与受氢体上氢原子间引力。其结协力较强于范德华引力；

4.疏水作用力：当抗原表位和抗体超变区靠近时，相互间正负极性消失，周围亲水层也马上失去，从而排斥二者间水分子，使抗原抗体深入吸引和结合。疏水作用力是这些结协力中最强，因而对维系抗原抗体结合作用最大。

现代抗体技术和其应用第8页抗原抗体反应特点

特异性、百分比性、可逆性。

特异性（specificity）是抗原抗体反应最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构互补性确定。

百分比性（proportionality）是指抗原与抗体发生可见反应需遵照一定量比关系，只有当二者浓度百分比适当初才出现可见反应，在抗原抗体百分比相当或抗原稍过剩情况下，反应最彻底，形成免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体百分比超出此范围时，反应速度和沉淀物量都会快速降低甚至不出现抗原抗体反应。

可逆性（reversibility）是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体特征。因为抗原抗体反应是分子表面非共价键结合，所形成复合物并不牢靠，能够随时解离，解离后抗原抗体仍保持原来理化特征和生物学活性。现代抗体技术和其应用第9页抗体技术

第一代抗体是传统抗体制备方法即利用抗原免疫动物后取得抗体，称为多克隆抗体（polyclonalantibody）；第二代抗体是经过杂交瘤技术制备出针反抗原中某一抗原决定簇抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)；

第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体(geneticengineeringantibody)。现代抗体技术和其应用第10页现代抗体技术和其应用第11页多克隆抗体多克隆抗体：有多个B细胞克隆所产上对特定抗原所产生一组免疫球蛋白混合物，每种免疫球蛋白能识别抗原分子上一个表位。所取得血清实际上是含有各种抗体混合物。现代抗体技术和其应用第12页多克隆抗体制备1.制备抗原2.选择试验动物3.动物免疫4.试取血进行测试效价，看看是否成功免疫5.假如成功免疫，处死试验动物，采集全部血清6.纯化抗体7.判定抗体，包含纯度以及特异性现代抗体技术和其应用第13页多克隆抗体制备-1.制备抗原1

颗粒抗原制备细胞抗原细菌类抗原2

可溶性抗原纯化纯化惯用方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。3

半抗原免疫原制备法半抗原：多肽，甾族激素，药品，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与对应抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。半抗原免疫原制备:

将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。现代抗体技术和其应用第14页多克隆抗体制备-2.选择试验动物供免疫用动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物选择依据抗体用途和量来决定，也与抗原性质相关。动物免疫应答受动物遗传基因影响，同一个系动物对不一样抗原免疫应答和不一样种系动物对同一抗原免疫应答均不尽相同。抗原起源与免疫动物亲缘较远，产生抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生抗体效价就差。假如需要大量抗体，则用大动物；如要取得直接标识诊疗抗体，则用本种动物；如要取得间接标识诊疗抗体，则用异源动物；如抗原量少，且难以取得，则用纯系小鼠；普通试验室用抗体，多用兔或者鼠。对于用于诊疗抗体，最好用SPF级动物。现代抗体技术和其应用第15页多克隆抗体制备-3.动物免疫抗原剂量：抗原免疫剂量应依据抗原免疫原性强弱、抗原起源难易、动物种类、免疫周期等来选择抗原剂量。免疫剂量过低，不能引发足够强免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引发免疫耐受。在一定范围内，抗体效价是随注射剂量增加而增高。蛋白质抗原免疫剂量比多糖类抗原宽。普通情况下，小鼠首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1000μg／次，家兔为500μg～1000μg/kg/次，加强剂量为首次剂量1／2～1／3。现代抗体技术和其应用第16页多克隆抗体制备-3.动物免疫注射路径：抗原进入路径决定了抗原吸收、分布和代谢速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响时间越短。吸收越快，单位时间有效抗原量就越大，机体免疫应答就越强，毒副作用也越强。依据免疫应答过程中各阶段特点，选择注射路径。惯用路径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。反抗原吸收速度：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌肉>皮下>皮内>掌内=跖内皮下。基础免疫应选择迟缓吸收路径，延长抗原刺激时间。现代抗体技术和其应用第17页多克隆抗体制备-3.动物免疫加强免疫时间：与抗原理化性质、剂量、进入路径、机体情况和所处免疫应答阶段相关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答早期，应延长间隔时间。两次注射间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应效果，太长则失去了前一次激发敏感作用。普通情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后2~3周，以后每7~10天加强一次。加佐剂间隔时间应为2周左右。注射Ig纯度高，则普通不易引发过敏反应，如注射血清，即使是少许，在再次免疫时，极易引发过敏反应，所以一定要采取办法。现代抗体技术和其应用第18页多克隆抗体制备-3.动物免疫加强免疫次数：抗原免疫原性强弱和动物反抗原敏感性相关。抗原免疫原性弱，需屡次加强才能获满意抗血清。得制备高度特异性抗血清,可选取低剂量抗原短程免疫法需要取得高效价抗血清，宜采取大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少许屡次。免疫周期短者，应大量少次。最简单方法是直接检测血清中抗体滴度，观察免疫效果。现代抗体技术和其应用第19页多克隆抗体制备-3.动物免疫佐剂概念和种类佐剂概念：佐剂是非特异性免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原特异性免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂种类1）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗)短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌内毒素。2）无机化合物：氢氧化铝、明矾等3）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（polyI:C)4）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油现代抗体技术和其应用第20页多克隆抗体制备-3.动物免疫佐剂生物学作用增加抗原免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效免疫原；提升抗体滴度，提升首次免疫应答和再次免疫应答抗体滴度；改变抗体类型，由产生IgM转变成IgG；引发或增强迟发型超敏反应。佐剂作用机制①改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留时间，从而更有效刺激免疫系统；②刺激单核巨噬细胞增强其反抗原处理和递呈能力；③刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答效应。现代抗体技术和其应用第21页多克隆抗体制备-3.动物免疫方法一：淋巴结注射法A.在兔两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg（每侧约0.30ml）。7-10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；B.于肿大两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂乳化抗原0.50ml（含抗原蛋白5mg/ml，青霉素1000U/ml，链霉素1000μg/ml）；C.必要时，14天后，重复步骤B一次；D.再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂乳化抗原0.50ml（含抗原蛋白5mg/ml，青霉素1000U/ml，链霉素1000μg/ml）；E.5-7天后，耳静脉采血。测定血清效价。现代抗体技术和其应用第22页多克隆抗体制备-3.动物免疫方法二皮下多点注射法A.家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.1ml，5mg/ml）；B.7-10天后，脊柱两侧多点（颈，胸，腰椎各两点，共6点）皮下注射含不完全佐剂抗原，每点0.5ml；C.7-10天后，脊柱两侧重复注射一次；D.7-10天后试血，不合格者重复步骤D。现代抗体技术和其应用第23页多克隆抗体制备-3.动物免疫方法三多路径联合注射法A.两侧掌（跖）内侧皮下注射含有完全佐剂抗原0.5ml，5mg/ml）；B.14天后，多点皮下注射含不完全佐剂抗原，每点0.5ml；C.7天后，耳静脉注射不含有佐剂抗原2ml；D.测定血清抗体效价，不合格者重复步骤C，并适当递增抗原量。现代抗体技术和其应用第24页多克隆抗体制备-4.效价评价1.琼脂扩散法原理：用半固体琼脂凝胶作为介质，可溶性抗原，抗体在其中能自由扩散。将可溶性抗原和抗体分别加入琼脂板上相对应孔中，二者各自向四面扩散，假如抗原和抗体相对应，则在二者百分比适当处形成白色沉淀线，以出现沉淀线最高抗体稀释度为该抗体效价。现代抗体技术和其应用第25页多克隆抗体制备-4.效价评价2.ELISA法（普通用于可溶性抗原）

若

ELISA

效价到达5,000

以上

(即血清稀释

5,000

倍浓度在ELISA

有

50%

最高呈色)，即可进行全部采血。现代抗体技术和其应用第26页多克隆抗体制备-4.效价评价3.凝集法原理：颗粒型抗原（完整病原微生物或者红细胞等）与对应抗体相结合，在有电介质存在条件下，经过一定时间，出现肉眼可见凝集小块。血清效价代表血清中康天一含量，血清效价越高，所含抗体量越多。比如，伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1:80以上才有诊疗价值。普通当效价到达1：1600到1:3200即可采血。现代抗体技术和其应用第27页多克隆抗体制备-5.血清制备最终一次取血能够采取颈动脉放血（以家兔为例）在搜集全血时加入肝素抗凝，对搜集到全血在室温下静置2hr后，4000rpm离心20min，取出上层血清后，每5mL分装一管，冷冻保留－20℃待用。现代抗体技术和其应用第28页多克隆抗体制备-6.抗体纯化

普通采取综合技术，防止蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等1.亲和纯化原理：蛋白A是从Staphylococcusaureus中取得，可与抗体重链Fc片段相结合。现在已知蛋白A可与各种哺乳动物IgG相结合也可与一些IgM和IgA相结合。假如将蛋白A与固相载体相连，比如sepharoseCL-4B，这种填料能够成为分离和纯化不一样类型，不一样亚类抗体或抗体片断主要工具。现代抗体技术和其应用第29页多克隆抗体制备-6.抗体纯化2.盐析法原理：蛋白质在水溶液中溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜程度，以及蛋白质分子带有电荷情况决定。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，因为离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，愈加造成蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。现代抗体技术和其应用第30页多克隆抗体制备-6.抗体纯化

盐析法试验步骤取1X

ml血清加1X

ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2X

ml饱和硫酸铵，硫酸铵终饱和度为50%。

4℃沉降3h以上，使其充分沉淀

离心（3000rpm），20min，丢弃上清，以x

ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

置4℃沉降3h以上。重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%

mol/l

pH7.4pbs溶解至x

ml装入透析袋。

↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

现代抗体技术和其应用第31页多克隆抗体制备-6.抗体纯化3.

DEAE离子交换层析法离子交换层析是蛋白质纯化常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用能够非常有效地纯化抗体原理：

DEAE是一个阴离子交换剂，当蛋白质溶液经过DEAE柱时，带负电荷蛋白质能够被DEAE吸

附，带正电荷蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电

点缓冲液，此时抗体带负电荷能够经过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度

方法将抗体洗脱。能够用连续梯度法洗脱，也能够用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。现代抗体技术和其应用第32页多克隆抗体制备-6.抗体纯化方法比较现代抗体技术和其应用第33页多克隆抗体制备-7.抗体判定1.纯度判定区带电泳、高效液相色谱、高压毛细管电泳采取区带电泳方法。若只出现一条蛋白区带说明抗体纯化已到达要求。2.特异性抗体特异性判定普通采取相同抗原与待判定抗体反应。假如出现交叉反应，说明有交叉抗体存在。此时，可用对应抗原吸收，以提升抗体特异性。

抗体特异性以交叉反应率表示，其计算方法以下：交叉反应率=[待测抗原50%结合时浓度]/[待判定类似物50%结合时浓度]·100%现代抗体技术和其应用第34页多克隆抗体制备-7.抗体判定3.亲和性抗体亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合牢靠程度。亲和力越大表示抗体结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。亲和力大小是由分子大小、抗体结合位点、以及抗原决定簇之间立体构型适合程度决定。亲和力决定试验方法灵敏度。所以，亲和力是评价抗体质量主要指标。

抗体亲和力大小以亲和常数表示，亲和常数就是表示抗血清中抗体分子浓度。可用饱和曲线法进行计算。现代抗体技术和其应用第35页单克隆抗体单克隆抗体

将一个制造一个专一抗体浆细胞进行培养，就可得到由细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一个抗原决定簇抗体，称为单克隆抗体现代抗体技术和其应用第36页单克隆抗体制备制备普通包含以下几个步骤：1.制备抗原2.选择试验动物3.动物免疫4.试取血进行测试效价，看看是否成功免疫现代抗体技术和其应用第37页单克隆抗体制备-5.细胞融合B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体小鼠骨髓瘤细胞不产生Ig重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞动物品系相同现代抗体技术和其应用第38页单克隆抗体制备-5.细胞融合培养骨髓瘤细胞：选择对数生长久细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐防止细胞返祖：定时用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中免疫脾细胞制备：1×108淋巴细胞无菌手术现代抗体技术和其应用第39页单克隆抗体制备-5.细胞融合喂养细胞细胞密度过低不利于细胞生长繁殖惯用小鼠腹腔细胞作喂养细胞，其中MQ还有去除死亡细胞作用；喂养存活普通不超出2周，不影响杂交瘤细胞纯化制备方法：用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后液体中即含有小鼠腹腔细胞，其中有巨噬细胞和其它细胞。在制备喂养细胞时候，切记针头刺破动物消化器官，不然所取得细胞会有严重污染。喂养细胞调至100000/ml，提前一天或者当日置板孔中培养。现代抗体技术和其应用第40页单克隆抗体制备-5.细胞融合融合剂1962年Okada首先用仙台病毒（流感病毒）诱导细胞融合成功，自发动物细胞发生融合频率很小，但当加入病毒后，细胞融合频率显著增大，因病毒磷脂包膜与动物细胞膜十分相同，一些病毒糖蛋白还有促进细胞融合功效，仙台病毒已成为公认细胞融合剂。聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）作为细胞融合剂，它可使邻近细胞膜粘合，继而使细胞合并起来。电穿孔融合术现代抗体技术和其应用第41页单克隆抗体制备-5.细胞融合

小白鼠脾脏细胞

B与

NS-1

细胞

N

以

PEG

进行融合，操作在

10min

內完成

，随即把细胞平均分配在

96

槽细胞培养盘中。现代抗体技术和其应用第42页单克隆抗体制备-6.初步筛选H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要路径T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞经过替换路径合成DNA正常B细胞利用HAT培养液中次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，在次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGRPT）和胸腺嘧啶激酶(TK)催化下经旁路合成DNA。骨髓瘤细胞是遗传基因缺点型细胞系，缺乏HGRPT或TK。现代抗体技术和其应用第43页单克隆抗体制备-6.初步筛选SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;

短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命杂交瘤细胞：长久生长繁殖利用淋巴细胞HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞取得产生某种抗体遗传信息从骨髓瘤细胞取得不停繁殖能力HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成主要路径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成替换路径受阻现代抗体技术和其应用第44页单克隆抗体制备-7.专一性筛选筛选专一性抗体：并非全部B细胞都会产生我们所要抗体，小白鼠原先就存在许多B细胞株反抗普通疾病，所以要用ELISA方法挑选出专一性抗体现代抗体技术和其应用第45页单克隆抗体制备-8.单株化阳性杂交瘤细胞克隆化培养有限稀释法(limitingdilution)显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)现代抗体技术和其应用第46页单克隆抗体制备-8.单株化有限稀释法

ELISA所挑出來细胞株，可能仍含有两群以上细胞，所以要进行单株化。先将该细胞株稀释，重新平分到

96

槽細胞培养盘中，计算使得每槽中只含一個细胞，待其生長成群落后，再次以

ELISA

筛选出专一性抗体。现代抗体技术和其应用第47页单克隆抗体制备-8.单株化FACS法应用FACS将特异性杂交瘤细胞选出单个放入96孔培养板中培养效率最高价格昂贵现代抗体技术和其应用第48页单克隆抗体制备-8.单株化显微操作法(micromanipulation)即在显微镜下，用毛细吸管挑选一个细胞进行培养。琼脂空斑法

将软琼脂中特异空斑，再在空斑中心取细胞现代抗体技术和其应用第49页杂交瘤细胞冻存与复苏配制方案：杂交瘤细胞（（1～5）x106/ml)+细胞冻存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出马上浸入37℃～40℃水浴中，使其快速融化、复苏预防污染防止染色体丢失预防非分泌细胞过分生长预防细胞密度过高而死亡现代抗体技术和其应用第50页单克隆抗体制备-9.抗体生产以及纯化1)

可把挑选出來融合细胞打入小鼠腹部，诱生肿瘤，然后以针头

搜集所产生

腹水，通常可取得

15mL

左右；腹水中抗体浓度非常高，每mL可达数

mg。

2)

把融合細胞在大型培养槽中培养，搜集培养液上清即得抗体，但每

mL

只好约数

mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种細胞培养瓶，可产生如腹水般浓度上清，但价格极为昂贵

(IBSIntegraBioscience:Integra

Celline)。现代抗体技术和其应用第51页单克隆抗体制备-10.抗体性质判定现代抗体技术和其应用第52页多克隆抗体与单克隆抗体比较多克隆抗体单克隆抗体起源动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点起源广泛、制备轻易纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应、制备成本低组成针对不一样抗原表位抗体混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用疾病被动免疫治疗广泛用于疾病诊疗、特异性抗原或蛋白检测和判定、疾病被动免疫治疗和生物导向药品制备缺点特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可造成人鼠抗体反应现代抗体技术和其应用第53页抗体分子改造和基因工程

自1975年Catton和Milstein等研究制造出单克隆抗体（MAb）技术以来，取得了快速发展和极为广泛应用。但也确实存在不少难以克服问题，如绝大多数Mab是鼠源性，对人有较强免疫原性。假如用于人治疗，不出2周就会产生人对鼠血清免疫应答，患者体内存在人抗鼠抗体（humananti-mouseantibody,HAMA），不但降低了疗效，严重可引发患者出现血清病。20世纪80年代中期人们开始尝试以基因工程方法改造鼠源性McAb,亦即所谓McAb“人源化”。1989年底英国剑桥Winter小组与Scripps研究所Lerner小组创造性工作。他们利用PCR技术克隆机体全部抗体基因,并重组于原核表示载体中,用标识抗原就可筛选到对应抗体,当初称为组合抗体库技术。20世纪90年代早期,这一技术有了深入发展,即将抗体基因与单链噬菌体(M13,Fd等)外壳蛋白融合并表示于噬菌体表面,以固相抗原吸附相对应噬菌体抗体,经屡次“吸附-洗脱-扩增”即可获所需抗体。现代抗体技术和其应用第54页基因工程抗体基因工程抗体又称重组抗体,

是指利用重组DNA

及蛋白质工程技术对编码抗体基因按不一样需要进行加工改造和重新装配,

经转染适当受体细胞所表示抗体分子。当前报道基因工程抗体很多,

分类方法不一,

大致能够分为三类：第一类，完整抗体分子第二类，抗体分子片段第三类，新型抗体分子现代抗体技术和其应用第55页经过基因重组改良抗体性能小分子抗体（穿透力强）人源化抗体（降低抗原性）双价或双特异性抗体（增强抗体亲和力及效－靶细胞相互作用）。抗体融合蛋白（增加蛋白半衰期；与药品，毒性分子或酶基因融和表示，可用于肿瘤等疾病治疗）。细胞内抗体（用于胞内治疗或信号转导研究）。现代抗体技术和其应用第56页基因工程抗体-1.完整抗体分子嵌合抗体人源化抗体完全人源抗体现代抗体技术和其应用第57页部分已同意上市治疗性单抗现代抗体技术和其应用第58页嵌合抗体(chimeric

antibody)由在基因水平上连接小鼠抗体V

区及人抗体C

区组成。这种抗体含75%～80%人抗体,

20%鼠抗体,

保留了原来鼠源单抗特异性,

但对人体仍具一定免疫原性。

现代抗体技术和其应用第59页嵌合抗体(chimeric

antibody)现代抗体技术和其应用第60页嵌合抗体(chimeric

antibody)现代抗体技术和其应用第61页人源化抗体(humanized

antibody)经过置换三个发夹状环鼠抗体超变区（CDR），使组成抗原结合部位轻重链各3

个CDR

区是鼠源,

其余均为人源。该抗体对人免疫原性大大降低,

但与抗原亲和力也有所下降。即使当前经过选择与鼠单抗同源性大抗体及改变骨架(fragment

region,

Fr)上一些关键氨基酸残基或遮蔽鼠单抗CDR表面残基(veneering)

等方法,

人源化抗体与抗原亲和力只能到达原先鼠源单抗33%～

35%。现代抗体技术和其应用第62页人源化抗体(humanized

antibody)

现代抗体技术和其应用第63页完全人源抗体首先把小鼠编码Ig重轻链基因剔除。制备表示人Ig重轻链转基因小鼠。上二种小鼠回交，取得只表示人Ig重轻链基因小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体现代抗体技术和其应用第64页完全人源抗体用人骨髓瘤细胞直接制备全人抗体关键点：建立好人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高现代抗体技术和其应用第65页展示技术现代抗体技术和其应用第66页噬菌体展示技术现代抗体技术和其应用第67页噬菌体抗体展示技术现代抗体技术和其应用第68页噬菌体展示抗体技术当单株细胞被挑选出來之后，能够分离出組成抗体轻链

(L)及

重链

(H)

mRNA，把他們变异区

(VL

及

VH)逆转录成cDNA後，以连接片段(Fv)接起來，並植入噬菌体

M13外壳蛋白基因中，就能够去感染大肠菌，並且繁殖大量M13噬菌体，就会在其外壳表现出所植入抗体

VL

+VH

片段，這是抗体最主要抗原結合區；因為這種片段保留了抗原結合區，但沒有其它Fc部份，所以能够应用用在很多方面。现代抗体技术和其应用第69页现代抗体技术和其应用第70页现代抗体技术和其应用第71页现代抗体技术和其应用第72页现代抗体技术和其应用第73页现代抗体技术和其应用第74页基因工程抗体-2.小分子抗体现代抗体技术和其应用第75页小分子抗体第一代小分子抗体———抗原结合片段(fragmentwithantigenbinding，Fab)和重组FabFab片段由完整轻链和重链VH+CH1组成，其大小为完整抗体1/3,约55KD；重组Fab是将轻、重链可变区分别与人抗体κ链和重链CH1重组；现代抗体技术和其应用第76页Fab基因工程构建方法及其性能

通常是保留鼠源性CDR区,其余换成人源化,经过大肠杆菌以分泌表示方式表示L链和Fd链,二者能在细菌外周质腔中折叠成含有一定构象Fab；该Fab含有抗体活性。因为其不含有Fc段、分子量小、结协力高、抗原性低,故在肿瘤治疗上有其优越性。当前已经有多个片段药品取得FDA同意上市.现代抗体技术和其应用第77页Fab临床应用1）阿昔单抗(abciximab，ReoPro)1994年12月FDA同意第一个重组Fab片段，该产品以血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa为靶点，用以预防血小板聚集及血栓形成，作为冠状动脉导管插术时预防心肌缺血辅助用药，取得了巨大成功；2）兰尼单抗(lucentis)：治疗黄斑变性，

年取得FDA同意。3）赛妥珠单抗(cimzia)：克罗恩病和风湿性关节炎，

年取得FDA同意。

在临床研究中，Fab占据了临床研发抗体片段大多数(30/54种)现代抗体技术和其应用第78页小分子抗体第二代小分子抗体-单链抗体(singlechainFv,ScFv)ScFv指在重链V区cDNA5’端与轻链V区cDNA5’端之间用一寡聚核甘酸连接,在大肠杆菌中表示成一单链多肽,并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区组成一个新型抗体,大小仅为完整Ig1/6(约28KD);

含有完整抗原结合部位最小抗体片段；现代抗体技术和其应用第79页ScFV功效1）用于治疗：可进人普通抗体不能到达部位,如蛋白偶联受体、酶活性部位和病毒表面腔囊等；2）多肽接头可设计为含有特殊功效位点：多肽接头是单链抗体独特组成,可设计为含有特殊功效位点：如金属赘合、连接毒素或药品等,用于影像和临床治疗；现代抗体技术和其应用第80页小分子抗体第三代小分子抗体———纳米抗体和分子识别单位(molecularrecognitionunit，MRU)纳米抗体主要指仅由一个重链可变区组成单域抗体(VHH)，其体积约为完整抗体1/10，故称为纳米抗体；1993年Hamers等偶然发觉骆驼体内存在一个仅含有重链抗体，被称为重链抗体(heavy-chainantibodies，HCAbs)。今后，在一些软骨鱼，如护士鲨体内也发觉类似骆驼重链抗体结构新抗原受体(newantigenreceptor，NAR)。这类抗体抗原结合位点仅由重链可变区VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH)单结构域形成，尽管缺失轻链可变区，却仍含有良好和广泛抗原结协力；克隆这种抗体重链可变区，构建仅由一个重链可变区组成单域抗体(VHH)。现代抗体技术和其应用第81页VHH稳定机制传统抗体VH和VL区经过疏水作用形成稳定结构，而重链抗体则经过选择性突变VHH胚系基因中几个功效位点，使其形成较高亲水性表面，可在缺失VL条件下保持结构稳定；现代抗体技术和其应用第82页纳米抗体单域性质1）有高度水溶性和构象稳定性：尽管缺失轻链可变区，却仍含有良好和广泛抗原结协力。而且因为在框架FR2区存在一些不一样于常规抗体亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中含有良好稳定性。在苛刻条件中，如胃液和内脏中仍能保持抗原结合活性，为口服治疗胃肠道功效紊乱性疾病提供新思绪；2）纳米抗体能识别独特抗原表位，因为含有伸展抗原互补结合区(CDR)以及更高组织穿透性和更小分子，VHH抗体能够结合一些常规抗体无法靠近抗原表位。可进入酶活性部位及细菌或病毒表面受体裂缝中，能够利用其模拟药品来设计小分子酶抑制剂、受体激动剂或拮抗剂等；3）能有效地穿过血脑屏障：有望成为治疗神经性疾病和脑肿瘤新药现代抗体技术和其应用第83页VHH胚系基因序列特征1）对骆驼VHH胚系基因序列分析发觉，VHH与人源VH基因Ⅲ家族序列含有较高同源性；2）比较人类和骆驼IgG重链可变区发觉，在框架FR2区氨基酸组成中，有4个氨基酸显著不一样。这4个氨基酸在VH和VHH中分别是V42F或V42Y，G49E，L50R和W52G，，利用这一特点,能够对人源抗体VH结构域FR2中一些氨基酸进行VHH特征性改造,所得到骆驼化单域VH抗体不但保持原有抗体特异性和亲和力,而且溶解性好、稳定性好。现代抗体技术和其应用第84页分子识别单位分子识别单位(molecularrecognitionunit，MRU)MRU是由单个互补决定区组成小分子抗体片段，约为完整抗体分子1/80～1/70。

MRU也含有与抗原结合能力，且因为其穿透力强、半衰期短、显像时本底低，在临床诊疗中含有潜在应用前景。现代抗体技术和其应用第85页基因工程抗表达状经过对小分子抗体基因改造和修饰，改进其亲和力、免疫原性及效应，构建出各种基因工程抗体片段.当前已经有54种基因工程抗体片段进入临床研究，其中30种源自Fab(56%)、19种源自ScFv(35%)、5种源自第三代小分子抗体(9%)现代抗体技术和其应用第86页双链抗体因为单价抗体片段(如ScFv、Fab)与靶抗原作用后保留时间短且解离速度快,所以在实际应用中有必要设计多价抗体分子,这种多价分子可显示出与抗原愈加强亲和力和慢解离速度；Fab和ScFv片段能够经过化学或基因工程linker组成二聚体、三聚体或四聚体。比如Fab就被用化学连成二价或三价多聚体,试验表明其与抗原保持性有所提升；现代抗体技术和其应用第87页双链抗体缩短Linker二价双链抗体ScFV0—5个氨基酸现代抗体技术和其