真菌检测的临床意义

真菌检测的临床意义第一页，共59页。真菌感染的分类根据真菌侵犯人体的部位分为四类：浅表真菌病皮肤真菌病皮下组织真菌病系统性真菌病浅部真菌病深部真菌病第二页，共59页。深部真菌感染深部真菌感染是一种重症感染，死亡率为40-90%真菌病的发病率呈上升趋势，尤其对重症监护病房和免疫缺陷患者、以及癌症患者，8%的院内感染由真菌引起白色假丝酵母、热带假丝酵母、光滑假丝酵母、隐球菌等是最常见的感染病原菌真菌感染的早期诊断、尽早开始治疗，是挽救患者生命的最重要的手段第三页，共59页。CompanyLogo4近年深部真菌变迁的特点

念珠菌血症：白色念珠菌为主呈下降趋势

非白念：光滑念珠菌，近平滑念珠菌和热带念珠菌，克柔念珠菌呈上升趋势

隐球菌、曲菌的比例上升。死亡率增加不同科室的病人发生感染的真菌不同,同一个体内可能发生两种或两种以上的真菌感染产生对氟康唑、两性霉素B的耐药菌株,并有增加的趋势第四页，共59页。近年来，非白色念珠菌的分离率有所上升

全球ARTEMISDisk研究结果显示：1997-2003年非白色念珠菌分离率有所升高10.5%(n=2475)9.3%(n=2047)9.2%(n=1112)10.7%(n=2431)10.2%(n=2635)11.5%(n=3974)分离率(%)

MAPfaller,etal.JClinMicrobiology.2005:5848-5859.第五页，共59页。侵袭性肺真菌感染的流行病学2005年南京军区总医院30例：曲霉31%，白念24%，光滑念17%，热带念13%，新生隐球菌、克柔念及近平滑念各3%2002～2006年北京协和医院152例肺真菌感染中确诊38例：曲霉39.5%，隐球菌34.2%、毛霉10.5%，念珠菌仅5.3%总之，目前仍以念珠菌感染为主，但发病呈下降趋势，白念减少，克柔念和光滑念增多；曲霉比例逐年增高，可能成为主要病原菌存在争议，主要因诊断标准不同，国外以组织病理学或组织培养为确诊依据，我国以痰或BALF培养为依据第六页，共59页。住院时间长高敏感性糖尿病肾衰竭血液透析急性胰腺炎广谱抗生素的使用中心静脉导管癌症和化疗肠外营养外科手术移植服用免疫抑制剂多处念珠菌定植

ICU中发生侵袭性念珠菌病的危险因素LuisOstrosky-ZeichnerCritCareMed2006;34:857–863第七页，共59页。ICU患者念珠菌血症的高危因素一项10年(1990-2000)的回顾性荟萃分析患者比例(%)

CharlesPEetal.IntensiveCareMed.2003;29:2162-2169.第八页，共59页。临床常见的条件性真菌感染念珠菌病:最常见，血源感染的第4位。曲霉菌病:常见于干细胞移植、实体器官移植、大剂量化疗患者和免疫缺陷患者。隐球菌病:艾滋病人患病率为10-20%。接合菌病（毛霉病）:多见于重症糖尿病、烧伤病及器官移植病人。第九页，共59页。临床有增多趋势的条件性真菌非白念念珠菌感染毛孢子菌感染地霉感染镰刀菌感染枝顶孢霉感染暗色真菌感染马尔尼菲青霉:目前已成为HIV阳性患者的主要条件致病菌第十页，共59页。CompanyLogo

真菌感染的实验室鉴定方法

形态学检查培养+鉴定血清学检查分子生物学检查其它：组织病理学，影像学第十一页，共59页。真菌直接涂片的诊断价值诊断阳性率高BALF培养阳性率40％，涂片64％，涂片＋培养67％(AnnInternMed1997,29:535;RespirMed1992,86:243)快速:2-4h可以报告结果：直接镜检，G染色，墨汁染色有助于鉴别感染类型是真菌丝还是假菌丝有隔菌丝：曲霉菌属唑类抗真菌药（伊曲康唑、伏立康唑）有效无隔菌丝：根毛霉属、根霉属、毛霉属、犁头霉属、小克银汉霉属两性霉素B敏感Thelancet,2003,3:230-240第十二页，共59页。马xx，右下支气管黄曲霉支气管液第十三页，共59页。Mucorspecies-MicroscopicMorphology,400xLactophenolcottonblue大型孢子囊,无囊托,无匍菌丝及假根第十四页，共59页。真菌培养结果可靠可进行分类鉴定到种，可进行药敏试验无菌部位分离出任何菌株，在未得到可靠证据证明其污染时，不应确诊为污染。有菌部位来源标本经两次或以上培养为同一结果时，可初步判断为感染菌。第十五页，共59页。真菌的血清学检测真菌细胞壁的成分1,3-β-D葡聚糖（G试验）:应用范围：曲霉菌、念珠菌、镰刀霉、毛孢子菌、(隐球菌、毛霉菌除外)真菌抗原半乳甘露聚糖抗原（GM试验）甘露聚糖抗原新型隐球菌的荚膜多糖抗原真菌特异性代谢产物D-阿拉伯糖醇

第十六页，共59页。真菌血清学检测方法优缺点

优点：报告结果快速敏感性高取样方便定量检测可判断感染严重程度及疗效评估缺点：特异性不高第十七页，共59页。真菌的分子生物学检测方法PCR方法：一步法PCR、巢式PCR菌种：念珠菌、隐球菌、曲霉菌第十八页，共59页。重要医学酵母菌分类条件致病酵母菌念珠菌属非念珠菌属白念珠菌非白念珠菌隐球菌属毛孢子菌属克柔念珠菌光滑念珠菌其它念珠菌热带念珠菌近平滑念珠菌季也蒙念珠菌葡萄牙念珠菌酵母属红酵母属第十九页，共59页。医学重要的霉菌分类霉菌曲霉属非曲霉属烟曲霉非烟曲霉黄曲霉黑曲霉土曲霉构巢曲霉镰刀菌属暗色孢霉赛多孢属接合菌链格孢霉属双极菌属万氏霉属弯孢属茄病镰刀菌尖孢镰刀菌尖端赛多孢多育赛多孢根霉属毛霉属根毛霉属梨头霉属小克银汉霉属第二十页，共59页。1.监测真菌耐药趋势2.为临床选择敏感的抗真菌药物3.为合理用药提供快速有效的依据4.并有助于临床真菌感染的管理真菌药敏试验的临床意义第二十一页，共59页。抗真菌药物体外敏感试验1.液体稀释法CLSIM27A2：致病性酵母菌CLSIM38A：产孢丝状真菌2.琼脂稀释法3.纸片扩散法——CLSIM44-ARoscoe纸片4.E－test法第二十二页，共59页。判读难点拖尾生长在唑类药物孔中的微弱生长(得分=1或2)导致对MIC值高估可能被误判为耐药Control例如:在如下所有氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑孔中都有拖尾生长12480.160.1250.250.51632641281241248FCAITRVRCMIC1MIC0.125MIC0.06第二十三页，共59页。FUNGUS-3的结果判读对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）是得分为“0”时的浓度；对于氟康唑（FCA）,伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC），鉴于可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度（MIC）为得分为“2”，“1”，或是“0”分时的浓度。生长现象得分和生长对照完全一样4比生长对照有轻微减少3比生长对照孔明显减少2非常微弱的生长1没有生长0第二十四页，共59页。氟康唑,伊曲康唑,伏立康唑:MIC值为得分为“2,1或0”的最小浓度1248得分=1:MIC=163264128FCA判读唑类结果肉眼判读第二十五页，共59页。E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，如念珠菌、隐球菌、曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等E-test检测曲霉MICE-test检测念株菌MIC

真菌E-test法第二十六页，共59页。纸片扩散法——CLSIM44-A

AB第二十七页，共59页。什么情况下需做体外药敏试验

建议在下列情况下：1、分离菌株来自血源性感染或其他无菌部位2、病原为非白念珠菌特别是光滑或克柔念珠菌或者其他霉菌3、抗真菌治疗疗效不佳4、拟采用唑类药物进行抗真菌治疗第二十八页，共59页。微生物室如何选择真菌药敏试验1.常量稀释法：尽管对真菌药敏试验的标准化起推动作用但日常工作中难推广2.CLSI纸片法：单个药敏意义不大3.ATBFUNGUS3做真菌药敏试验较为可行。

且ATBFUNGUS3能提供MIC值。4.临床寄希望将来推行Etest法其是一个很有应用前景的临床实验室抗真菌药敏试验方法。第二十九页，共59页。对假丝酵母菌属的结果解释SIR5-氟胞嘧啶48-1632两性霉素B未定义未定义2氟康唑816-3264

伊曲康唑0.1250.25–0.51

伏立康唑124CLSI折点:第三十页，共59页。SIR5-氟胞嘧啶48-1632两性霉素B未定义未定义2氟康唑4816

伊曲康唑未定义未定义未定义

伏立康唑未定义未定义未定义目前没有官方推荐，文献提供如下信息对新型隐球菌的结果解释第三十一页，共59页。多烯类：两性霉素B、制霉菌素（与麦角固醇结合）非多烯类：灰黄霉素唑类药物：

1.三唑类药物:氟康唑、伊曲康唑（抑制麦角固醇合成）2.咪唑类：酮康唑丙烯胺类:特比萘芬（抑制乙酰辅酶A）合成抗真菌药物:5-氟胞嘧啶（阻断核酸合成）新型抗真菌药物

1.第二代三唑类药物:伏立康唑、泊沙康唑2.棘白菌素类:卡泊芬净、米卡芬净（抑制葡聚糖合成）3.尼可霉素Z（抑制甲壳质合成）4.普拉米星和贝拉米星（抑制甘露聚糖蛋白）临床常用的抗真菌药物第三十二页，共59页。37th热病：抗真菌药物活性真菌氟康唑伏立康唑泊沙康唑棘白菌素类多烯类白念珠菌+++++++++++++++光滑念珠菌+/-+++++++++热带念珠菌+++++++++++++++近平滑念珠菌+++++++++++（高MIC）+++克柔念珠菌—++++++++++季也蒙念珠菌+++++++++++(高MIC)++新型隐球菌+++++++++—+++—无活性；+/—可能有活性；+有活性，三线（至少临床有效）++有活性，二线（作用稍差）；+++有活性，一线（常常有效）第三十三页，共59页。37th热病：抗真菌药物活性真菌氟康唑伏立康唑泊沙康唑棘白菌素类多烯类烟曲霉——++++++++++黄曲霉——++++++++++（高MIC）土曲霉——++++++++——镰刀霉——++++——++（脂质）尖端赛多孢——+++++++/—+/—多育赛多孢——+/—+/———+/—犁头霉/毛霉/根霉————+++——+++（脂质）—无活性；+/—可能有活性；+有活性，三线（至少临床有效）++有活性，二线（作用稍差）；+++有活性，一线（常常有效）第三十四页，共59页。1997-2005ARTEMIS

念珠菌对氟康唑耐药率变迁PfallerMA,etal.JCM.07:1735.第三十五页，共59页。2001-2005ARTEMIS

念珠菌对伏立康唑耐药率PfallerMA,etal.JCM.07:1735.第三十六页，共59页。耐氟康唑菌株%（直径<=14mm）种属ARTEMISDISKSurveillanceProgram白色1.01.61.5光滑18.522.814.318.314.716.914.315.215.8热带3.06.65.0近平滑2.03.93.0克柔56.571.568.1

70.478.9

80.278.179.277.8体外研究中念珠菌对氟康唑的耐药情况白色、热带、近平滑念珠菌对氟康唑的敏感性仍较好，但是光滑和克柔的耐药率高。97-9899000102030405总计Pfaller.JClinMicrobiol2005Pfaller.JClinMicrobiol2007第三十七页，共59页。1997-2007ARTEMIS

非念珠酵母菌氟康唑耐药率PfallerMA,etal.JCM.07:1735.第三十八页，共59页。1997-2007ARTEMIS

非念珠酵母菌伏立康唑耐药率PfallerMA,etal.JCM.07:1735.第三十九页，共59页。第四十页，共59页。酵母菌敏感性小结大多数酵母菌对氟康唑敏感性>90%克柔念珠菌对氟康唑类天然耐药，红酵母属氟康唑耐药率约50%光滑念珠菌耐药率在10~20%,另有~10%SDD分离自不同标本的念珠菌，敏感性无明显差异MIC不能完全预测临床疗效,但是Dose／MIC＞25时临床有效率91~99%念珠菌出现继发感染，患者之前用过三唑类可能耐药真菌药敏报告提示：“真菌药敏试验结果仅供临床参考”第四十一页，共59页。771株曲霉唑类敏感性菌种株数伊曲康唑泊沙康唑雷夫康唑伏立康唑MIC50MIC90MIC50MIC90MIC50MIC90MIC50MIC90烟曲霉5530.5黄曲霉760.50.511黑曲霉592>80.51240.51土曲霉30.250.5杂色曲霉24120.510.510.51构巢曲霉50.5NA0.12NA0.12NA0.12NA萨氏曲霉42NA0.25NA0.25NA0.25NAA.calidoustus42NA2NA1NA2NATotal7710.510.250.5PfallerMA,etal.JCM.08:2568第四十二页，共59页。Hope试验aspergillus烟曲霉黄曲霉黑曲霉土曲霉构巢曲霉第四十三页，共59页。37th热病：抗真菌药物活性真菌氟康唑伏立康唑泊沙康唑棘白菌素类多烯类烟曲霉——++++++++++黄曲霉——++++++++++（高MIC）土曲霉——++++++++——镰刀霉——++++——++（脂质）尖端赛多孢——+++++++/—+/—多育赛多孢——+/—+/———+/—犁头霉/毛霉/根霉————+++——+++（脂质）—无活性；+/—可能有活性；+有活性，三线（至少临床有效）++有活性，二线（作用稍差）；+++有活性，一线（常常有效）第四十四页，共59页。37th热病：抗真菌药物活性—无活性；+/—可能有活性；+有活性，三线（至少临床有效）++有活性，二线（作用稍差）；+++有活性，一线（常常有效）真菌氟康唑伏立康唑泊沙康唑棘白菌素类多烯类暗色真菌：链格孢、离蠕孢——+++—+++弯孢霉属外瓶霉等+/—++++++++双相真菌

伊曲康唑皮炎芽生菌++++++++粗球孢子菌+++++++—+++荚膜组织胞浆菌+++++—+++申克孢子丝菌+++++—+++第四十五页，共59页。丝状真菌敏感性小结烟曲霉：极少有耐药株黄曲霉：两性霉素B的MICs较高黑曲霉:伊曲康唑有耐药菌株土曲霉：两性霉素B耐药接合菌:两性霉素B脂质体对活性较高接合菌、某些曲霉、暗色真菌：手术切除病灶严重免疫抑制/低下者，治疗成功需要免疫重建结合CT、GM、G试验等早期诊断，早期治疗第四十六页，共59页。体外药敏试验与临床疗效的相关性第四十七页，共59页。念珠菌仍是目前临床最常见的致病真菌InvitroSusceptibilityofInvasiveIsolatesofCandidaspp.ToAnidulafungin.Caspofungin,andMicafungin:SixYearsofGlobalSurveillanceJOURNALOFCLINICALMICROBLOLOGY.JAN.2008.150-156第四十八页，共59页。念珠菌感染具有很高的发病率及死亡率院内血流感染前4位病原体的分布和死亡率百分比(%)凝固酶阴性葡萄球菌金黄色葡萄球菌肠球菌念珠菌2.WisplinghoffHetal.ClinInfectDis.2003;36:1103-1110.818/2711311/2711230/2711315/2711185/55352/24584/18861/228自1995年至2001年由美国49所医院对2340例院内血流感染患者进行的一项大型前瞻性研究，分析研究院内血流感染最常见的致病菌及其药物敏感性。第四十九页，共59页。早期治疗侵袭性念珠菌感染可降低患者死亡率11.1％<12小时12-24小时24-48小时>48小时一项对念珠菌血流感染患者进行的回顾性研究结果院内死亡率(％)*自首次阳性血培养的血标本采集后开始计时一项自2001年至2004年对157例念珠菌血流感染患者进行的回顾性、队列研究，比较分析开始抗真菌治疗时间与患者死亡率的关系。4.MorrellMetal.AntimicrobAgentsChemother.2005;49:3640-3645.12*小时后平均死亡率为33.1%P=0.169第五十页，共59页。早期使用大扶康®可显著降低患者死亡率12.KevinW.etal.ClinInfectDis.2006;43:25–31.死亡率(%)P=0.0009采集血培养当天*采集血培养后1天*采集血培养后2天*采集血培养后≥3天*一项4所医学中心对230例念珠菌血症患者进行的回顾性队列研究结果采集血培养后≥3天开始使用大扶康抗真菌治疗，患者死亡率高达41.4%41.4%*自首次阳性血培养的血标本采集后开始计时自2002年1月至2005年1月，由美国4所医学中心参加的回顾性队列研究，分析230例念珠菌血症患者开始氟康唑治疗的时间与死亡率的关系。第五十一页，共59页。治疗念珠菌感染——2009IDSA念珠菌病治疗指南侵袭性念珠菌病治疗首选备选备注念珠菌血症非粒缺患者氟康唑首日负荷剂量800mg/日，继而400mg/日；或棘白菌素两性霉素B脂质复合体；或两性霉素B；或伏立康唑首次阴性血培养和临床症状及体征缓解后继续治疗14天粒缺患者棘白菌素或两性霉素B脂质复合体氟康唑首日负荷剂量800mg/日，继而400mg/日；或伏立康唑氟康唑适用于未使用过三唑类药物的非重症患者疑似念珠菌病(经验性抗真菌治疗)非粒缺患者同非粒缺患者的念珠菌血症两性霉素B脂质复合体；或两性霉素B棘白菌素适用于中重度和/或曾使用过三唑类药物患者。疗程尚未确定，但若培养和/或血清学检测显示阴性时则停药粒缺患者两性霉素B脂质复合体；卡泊芬净；或伏立康唑氟康唑首日负荷剂量800mg/日，继而400mg/日；或伊曲康唑多数粒缺患者抗生素治疗4天后仍持续发热者需要经验性抗真菌治疗PappasPGetal.ClinicalInfectiousDiseases2009;48:503-35.bid：每日2次第五十二页，共59页。治疗念珠菌感染——其他国际权威指南念珠菌病首选血路感染：临床稳定，有或无静脉导管，不像是光滑念珠菌或克柔念珠菌氟康唑≥6mg/kg/日或400mgivqd或poX治疗7天；或poX14天，在末次血培养阳性后14天腹膜炎(长期非卧床腹膜透析)氟康唑

400mgpoqdX2-3周；或卡泊芬净或米卡芬净念珠菌阴道炎(非艾滋病患者)慢性复发氟康唑

150mgpoX1天，然后150mgpoqwk1.GilbertDN,etal.TheSanfordGuidetoAntimicrobialTherapy2009iv：静脉滴注；po：口服给药；qd：每天1次；bid：每天2次。

39版《热病》1念珠菌病首选阴道炎全身用药及复发氟康唑尿路感染氟康唑口咽/食道感染氟康唑或棘白菌素类念珠菌血症氟康唑或棘白菌素类或两性霉素B

2008

TheMedicalLetter指南22.TreatmentGuidelinesfromTheMedicalLetter2008;65(6).

欧洲系统性真菌感染临床指南(第三版)33.MalcolmDRichardson,BrianLJones.TherapeuticGuidelinesSystemicFungalInfections.ThirdEdition.CurrentMedicalLiterature.念珠菌病治疗方法尿路感染氟康唑

200mg/日X7-14天非中性粒细胞减少念珠菌血症移除所有静脉导管；氟康唑800mg负荷剂量，随后400mg/日X

2周葡萄牙假丝酵母菌血症氟康唑

400mg/日急性播散性念珠菌病病情较轻患者视菌株，氟康唑800mg/