细胞培养的基本方法

细胞培养的基本方法

目前一页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染和检测细胞培养中常用的染色方法培养细胞的观察ACB目录目前二页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察无论是研究体外细胞的增殖生长状态还是生物学性状，都需要对其进行观察和检测，其内容涉及形态生物学、细胞生物学、遗传学、生理生化、分子生物学等多学科的技术手段。这里主要介绍观察检测体外培养物最常用的技术方法。目前三页\总数三十七页\编于二十一点相差显微镜相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的，用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（x相位差），这种相位差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。目前四页\总数三十七页\编于二十一点一、相差显微镜观察：能增强结构之间的反差1、主要装置（1）环装光栅不同倍数的相差物镜要用相应的环状光阑（2）相板相差板上上装有吸收膜及推迟相位的相位膜（3）中心望远镜辅助望远镜培养细胞的观察目前五页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察2、观察活细胞的方法

将相差装置与倒置光装置结合起来而制造的倒置相差显微镜广泛用于观察生长在瓶皿底面的细胞。目前六页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察3、相差物镜的选择与使用正（暗,即标本比周围环境暗）反差适用于物体细微结构和形态、计数、运动的观察。PL（低亮，视场平坦型物镜）相差物镜常用于折射率比较弱的物体，PLL（低低亮，长工作距离平场物镜）则适用于折射强的物体。负（明，即标本比周围环境亮）反差适用于物体形态、计数和物体运动的观察，物体折射率比较弱是采用NM（中负）相差物镜，折射率比较强时采用NH（高负）相差物镜。目前七页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察4、相差显微镜使用注意事项1）当换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调中，否则成像效果不佳；2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，以免影响观测效果；3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像效果才明显；4）光路最好加单色（如黄绿色）滤光片以提高相差显微镜的分辨率。目前八页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察二、细胞计数法1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。目前九页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞中的细胞分裂相数。4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和部分底物材料的生物相容性。目前十页\总数三十七页\编于二十一点培养细胞的观察

5、细胞周期这里的细胞周期仅指一个细胞的分裂生长周期时间，而不是指细胞群体倍增时间。可利用培养细胞来研究细胞动力学、DNA合成代谢和有丝分裂。细胞周期的时间测定有两种方法。（1）同位素标记测定法（2）流式细胞仪测定法6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）比色法测定细胞活力。目前十一页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-活体染色一、活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。1、活体染料的类别可分为碱性和酸性活体染料两大类。碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦油蓝、亮焦油紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）。

酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。目前十二页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-活体染色2、活体染色方法（1）台盼蓝染色1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液；2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞；3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液；4）每毫升细胞悬液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀；5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数；6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色）数目。目前十三页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-活体染色

目前十四页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-活体染色

（2）吖啶橙荧光染色法

吖啶橙用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。与DNA结合呈亮绿色，与RNA结合呈橘红色至火红色。目前十五页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-活体染色

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色目前十六页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法二、染料排除检测法由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞由于能排出进入细胞的染料，故不易着色。1、台盼蓝排除检测法目前十七页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法

2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法EB和PI均为荧光染料，可与DNA特异性结合。目前十八页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测在细胞培养中，凡是与培养无关的杂质的混入培养系统称为污染。对于组织细胞培养工作来说，污染是时常存在的，因此要努力避免污染的发生。污染一般包括微生物、化学物、细胞等，其中微生物污染较多。以下着重介绍微生物的污染、预防与检测。目前十九页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染途径

一、污染途径1、空气空气是微生物及粉尘颗粒传播的最主要途径。2、器材各种培养皿及器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染。3、操作无菌操作观念不强、实验操作马虎、动作不准确、使用污染的器具或密封不严等，都可能造成污染。同时培养两种以上细胞，操作不规范，交叉使用吸管或者营养液瓶等会导致细胞交叉感染。目前二十页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染途径4、血清有的市售血清制备水平低、检测不严，常被支原体和病毒污染。5、组织样本初代组织常有污染，有的在手术中污染，有的本身可能是被污染的组织（如已发生溃烂的肿瘤组织）。手术用碘酒消毒后，擦拭不净从而出现碘污染。目前二十一页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测

二、污染对培养细胞的影响与检测

体外培养的细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入抗生素的抗污染能力也很有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回。一般在细胞受到有害污染的早期或污染较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复，所以对培养细胞的污染与检测极其重要。目前二十二页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测1、细菌污染及检测

细菌是一种原核生物，其大小以微米计。常见的污染菌有革兰式阴性菌（其中白色葡萄菌等比较常见）和E.coli、假单胞菌等。细菌污染初期不易判断。有怀疑时可取细胞悬液离心沉淀后加入无抗生素的培养液中培养观察24h，看是否为阳性（受到污染）结果。多数情况下受到细菌污染后培养液短期内颜色变黄，产大量酸性物质，出现明显浑浊。还可用倒置显微镜观察，现象明显。青霉素、链霉素预防细菌污染有效。目前二十三页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测

2、真菌的污染与检测在微生物污染中，以真菌的污染最多，常见的有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌。真菌污染后易发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见，还可用倒置显微镜观察散在生长在培养液中的真菌。瓶外的污染物要及时用酒精棉球擦洗干净，以防其通过瓶口传入瓶内。抗真菌剂对预防和排除真菌污染有效。目前二十四页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测3、支原体污染与检测支原体是一种介于细菌和病毒之间、能独立生活的最小微生物，最小的直径0.2微米，约有1%可通过滤菌器，无细胞壁，形态呈多形性，可为圆形、丝状或梨形。目前常用检测方法有相差显微镜检测法、DNA荧光处理法、电镜检测法、低张处理地衣红染色观察、免疫学法、-胸腺嘧啶渗入、支原体培养法及PCR法等。目前二十五页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测

4、病毒的污染与检测病毒是一种能通过细菌滤器，大小以纳米计，不能单独利用外界营养物质进行自体繁殖的微生物。病毒进入细胞后会进行装配形成新的病毒，或将遗传物质整合到宿主DNA上，从而影响到细胞的生长或干扰实现结果的准确性。对病毒进行检测主要有细胞直接观察法、动物接种检查法、电子显微镜检查法、免疫学及PCR法等。目前二十六页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测

5、细胞交叉污染检测细胞间交叉污染是由于在培养操作过程中各种细胞同时进行培养，而所有器具或液体混杂使用所致。这种污染有的变化轻微不易察觉，有的可能因污染细胞具有生长优势而使原培养细胞生长受到抑制，最终死亡。常用观察细胞形态、检查细胞的标记物等方法检查交叉污染的细胞。为有效防止交叉污染，应该做到：1）器具严格区分，做好标记；2）换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及培养液瓶瓶口。3）从别处转来的细胞或自己建立的细胞系都要早期留有充足的冻存储备。目前二十七页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染的预防三、污染的预防1、培养操作前的准备1）定期清洗或更换超净工作台的空气滤网，定期检查超净工作台的空气净化标准；2）检查培养皿是否有消毒标志；3）检查新配置的培养液，取样检菌一周后确认无菌方可使用；4）操作前提前30min启动超净工作台及其紫外消毒灯；5）操作者应清洗双手，如有呼吸道感染应戴口罩。目前二十八页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染的预防2、培养操作时注意事项1）工作台上的所有培养瓶瓶口不能与工作台上的风向相逆，不能用手碰器皿无菌部分；2）在安装吸管帽、开启或封闭瓶口时要经火焰灼烧，并在火焰附近进行；3）吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用；4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后培养液保持斜立，培养的细胞在处理之前勿过早的暴露于空气中；5）操作时不要交谈咳嗽以防止唾沫和呼出的气流所造成的污染；6）操作完后应整理好工作台面，用消毒剂抹拭工作面，关闭超净工作台。目前二十九页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染的预防

3、其他注意事项1）及早冻存有价值的培养物，重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立完成；2）购入未灭活血清应于56℃水浴灭活30min，以使血清中的补体和支原体灭活；3）避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素；4）对新引进的细胞株应加强观察，防止外来污染源；5)定期用消毒剂清洁二氧化碳培养箱。目前三十页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染排除

四、污染排除

培养细胞的污染一旦确定，多数将无法救治。如果污染的细胞不具备重要价值则尽快弃之，防止造成更大的污染，只有那些必须保留的贵重细胞和单抗细胞等，才有必要进行污染排除。防止关键在于严格无菌操作。目前三十一页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染排除1、抗生素的应用平时抗生素主要用来杀灭微生物，而细胞培养工作采用抗生素多为预防污染。常用多钟抗生素联合应用，用于预防比污染后使用好。使用多了容易使微生物产生抗药性，因此尽量少用。但对于一些有价值的细胞，仍需用抗生素挽救。部分抗生素参考用量和效果如下表：目前三十二页\总数三十七页\编于二十一点细胞培养的污染与检测-污染排除

2、加温处理根据支原体对热耐性差的特点，有人把受污染的细胞置41℃中总15～10h，最长可达18h，以杀灭支原体。41℃对