第三章动物细胞工程制药演示文稿

第三章动物细胞工程制药演示文稿目前一页\总数九十八页\编于六点优选第三章动物细胞工程制药目前二页\总数九十八页\编于六点细胞工程是一门应用科学和工程技术，具体包括：真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术细胞融合的理论和技术细胞器特别是细胞核抑制的理论和技术染色体改造的理论和技术转基因动植物的理论和技术细胞大量培养的理论和技术有关产物提取纯化的理论和技术目前三页\总数九十八页\编于六点第二节动物细胞的形态和生理特性离体培养的细胞可分为两类：贴壁依赖型细胞和贴壁非依赖型细胞，前者可简称为贴壁细胞，后者简称为悬浮细胞。动物细胞高度分化。一、动物细胞的形态目前四页\总数九十八页\编于六点1.贴壁细胞贴壁细胞必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或者培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。目前五页\总数九十八页\编于六点贴壁细胞在表面生长后一般形成两种形态——纤维样细胞和上皮样细胞。纤维样细胞：主要来自中胚层组织的细胞（成纤维细胞、心肌细胞、成骨细胞、平滑肌细胞）上皮样细胞主要外胚层和内胚层的组织细胞（皮肤细胞、肠管上皮细胞和肺泡上皮细胞等）目前六页\总数九十八页\编于六点2.悬浮细胞悬浮细胞的生长不依赖支持物表面，可以在培养液中呈悬浮状态生长（血液中的淋巴细胞、Namalwacell）3.兼性贴壁细胞既可以贴附于支持物表面生长，在一定的条件下，也可以在培养液中呈悬浮状态良好地生长。目前七页\总数九十八页\编于六点二、动物细胞的分化组成和代谢1.动物细胞的化学组成水、无机盐、蛋白质、糖、脂类和核酸组成。细胞中水占绝大多数，占细胞鲜重的85%-95%，无机盐占1.5%，蛋白质占7%-10%，脂类占1%-2%，其他物质占1.5%。目前八页\总数九十八页\编于六点2.动物细胞的代谢糖、脂、蛋白质等有机物大分子的代谢一般都可以分成三个降解阶段：①生物大分子降解为小分子；②小分子物质进一步代谢转化为三个主要的中间产物——乙酰辅酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸；③三种中间产物进入TCA循环，为动物的生命活动供能。目前九页\总数九十八页\编于六点在氧气供应不足或者剧烈运动造成的局部缺氧时，动物细胞可以进行无氧呼吸——糖酵解供能。在动物细胞的体外培养中，供能物质主要是葡萄糖和谷氨酰胺。目前十页\总数九十八页\编于六点三、动物细胞特点1.细胞的分裂周期长同细菌、酵母比较不同种属、同种属不同组织比较2.细胞生长需贴附基质，并有接触抑制现象（密度依赖抑制）二倍体特有。目前十一页\总数九十八页\编于六点3.正常细胞的生长寿命是有限的细胞从离体培养开始，我们称之为原代培养，随后细胞经过传代后，即成为有限细胞系。细胞经过一些人为的或自然的因素转化为异倍体后，细胞就可转变为无限细胞系，或称连续细胞系。这种细胞的寿命是无限的，适合工业化生产的需要。有癌变的特点，但并不是癌细胞；癌细胞可以通过无限增殖成为无限细胞系。目前十二页\总数九十八页\编于六点4.动物细胞对周围环境敏感动物细胞有膜无壁。5.动物细胞对培养基的要求高至少12种必需的氨基酸、8种以上的维生素、必要的无机盐和微量元素、作为碳源的葡萄糖，还需要多种细胞生长因子和贴壁因子才能生长。

不同的细胞对培养基的要求也会有所不同。目前十三页\总数九十八页\编于六点6.动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同动物蛋白合成场所：游离核糖体和糙面内质网结合的核糖体。游离核糖体：细胞质基质内蛋白；糙面内质网结合核糖体：分泌蛋白和膜中整合蛋白，修饰后成为糖蛋白。细菌：无糙面内质网。目前十四页\总数九十八页\编于六点利用动物细胞作为宿主细胞生产药品优势：①蛋白多分泌到细胞外，易于收集和纯化；②具有完善的翻译后修饰系统，产物更接近天然，适用于临床。利用动物细胞作为宿主细胞生产药品缺点：培养条件苛刻，成本高，产量低。目前十五页\总数九十八页\编于六点第三节生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求不是所有的动物细胞都可以用于生产人用的药品。原代细胞→二倍体细胞→异倍体细胞现在基本上已经取消了生产用动物细胞必须用传代细胞的限制，但是对最终产品中的DNA含量做了严格的要求。目前十六页\总数九十八页\编于六点二、生产用动物细胞的获得生产中的动物细胞有：原代细胞、二倍体细胞系、无限传代细胞系和利用上述3种细胞进行融合和重组的工程细胞系。1.原代细胞直接取自动物组织、器官。目前十七页\总数九十八页\编于六点2.二倍体细胞系原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出具有某些特征的细胞株，这类细胞仍然是二倍体核型，具有贴壁依赖和接触抑制特性，无致瘤性，一般从动物胚胎组织中获取。目前十八页\总数九十八页\编于六点3.转化细胞系异倍体细胞，没有正常细胞的特点，可以无限增殖。自发形成：啮齿动物。人工转化：病毒或化学试剂。目前十九页\总数九十八页\编于六点4.融合细胞系细胞融合是指两个或两个以上细胞合并成一个细胞的过程。诱导仙台病毒和聚乙二醇（PEG）高压电场的电融合目前二十页\总数九十八页\编于六点（1）仙台病毒融合法①病毒加入两种细胞后，4℃条件下，病毒附着在两种细胞的细胞膜上，使两种细胞互相凝聚。②在37℃条件下，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破坏；③两个细胞的连接部位穿通，周边连接部修复。④细胞融合。少用（感染困难、融合慢、去病毒困难）目前二十一页\总数九十八页\编于六点（2）聚乙二醇融合法产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备。（3）电融合法

利用电场进行人工诱导细胞融合，是利用细胞在短时间的电场作用下，细胞膜发生可逆性的电击穿，而使相邻的细胞的细胞膜相互发生继发性融合。操作简便、无化学毒性、对细胞损伤小、融合同步和融合率高，可在显微镜下直接观察融合情况。目前二十二页\总数九十八页\编于六点5.重组工程细胞系利用基因工程技术手段重组的各种细胞系。三、基因工程细胞的构建和筛选1.真核细胞基因表达载体的构建载体病毒载体质粒载体腺病毒杆状病毒目前二十三页\总数九十八页\编于六点杆状病毒作为载体的优点：（1）杆状病毒基因组是双链DNA，容易进行重组；（2）可插入较大片段的外源表达基因，插入7-8kb外源基因而不影响正常病毒粒子的形成；（3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染能力的病毒粒子；（4）多角体蛋白基因有强启动子，蛋白表达量较高；（5）多角体是一个明显的标记物，可以直接用显微镜观察，易于筛选阳性克隆；（6）如果是家蚕杆状病毒作载体，可以直接在家蚕体内进行外源基因表达。目前二十四页\总数九十八页\编于六点2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选磷酸钙沉淀法和电穿孔法。磷酸钙沉淀法是将溶解的DNA加在Na2HPO4溶液内，再逐渐加入CaCl2溶液，当二者形成磷酸钙沉淀时，DNA被包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸钙共沉淀物，当该沉淀与细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将DNA导入其中。目前二十五页\总数九十八页\编于六点筛选已经整合外源基因的工程细胞主要依靠构建的载体内的选择标记来进行，筛选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化，并利用其自身的扩增系统，不断增加拷贝数，从而获得高效表达的稳定的工程细胞株。目前二十六页\总数九十八页\编于六点四、常用生产用的细胞特性BHK-21细胞：从生长1天的幼鼠肾脏分离的经13次克隆的成纤维样细胞，核型2n=44，DMEM培养基添加7%牛血清培养，常被用于增殖病毒和制备疫苗，现也被用于工程细胞的构建。C127细胞：来自RⅢ小鼠肿瘤细胞，适用于携带有牛乳头瘤病毒的载体的转染。目前二十七页\总数九十八页\编于六点CHO-K1细胞：从鼠卵巢中分离的上皮样细胞，核型2n=20~22，用DMEM培养基加0.1mmol/L次黄嘌呤和0.01mmol/L胸苷、10%小牛血清，并需额外添加脯氨酸。COS细胞：通过利用复制起点缺失的SV40病毒基因组DNA转化非洲猴肾细胞CV-1获得，是广泛应用的瞬时表达系统。目前二十八页\总数九十八页\编于六点MDCK细胞：从成年西班牙狗的肾脏分离的贴壁依赖型上皮样细胞，能进行多种病毒的增殖，常被用来生产兽用疫苗。MRC-5细胞：从14周男胎肺组织获得的成纤维样二倍体细胞，核型2n=46，BME培养基加10%小牛血清培养。目前二十九页\总数九十八页\编于六点Namalwa细胞：从肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的患者体内获取后构建的一株人的类淋巴母细胞，该细胞是完全分化的B淋巴细胞，有2.8%的高倍体率，常用培养基为RPMI1640，需添加7%胎牛血清培养，外源蛋白表达水平很高。Sf-9细胞：从秋黏虫的蛹卵组织中分离出亲代细胞后克隆形成，对苜蓿尺蠖核型多角体蛋白病毒和其他的杆状病毒高度敏感，利用Grace培养基添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液及10%胎牛血清培养。目前三十页\总数九十八页\编于六点Vero细胞：从正常的成年非洲猴肾中分离的贴壁依赖性成纤维细胞，核型2n=60，高倍体率1.7%，利用199培养基添加5%太牛血清培养，可支持多种病毒的增殖并制成疫苗。WI-38细胞：从女性高加索人的正常胚肺组织中获得成纤维样二倍体细胞，核型2n=46，利用BME培养基添加10%小牛血清培养。目前三十一页\总数九十八页\编于六点鼠骨髓瘤细胞：具有很轻增殖能力的可以无限培养的细胞。分泌量大、容易转染、易生长、可以在无血清培养基中高密度悬浮培养，而且能对蛋白进行糖基化修饰，表达机制明确。SP2/0-Ag14细胞：从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合后形成的SP2/HL-Ag再亚克隆后分离获得，常用DMEM培养基添加10%胎牛血清培养，广泛的用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。目前三十二页\总数九十八页\编于六点五、细胞库的建立用于生产的工程细胞必需建立两个细胞库：原始细胞库（MCB)和生产用细胞库（MWCB）（工作细胞库,WCB）。MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，二倍体细胞要尽量是群体倍增水平低的细胞。目前三十三页\总数九十八页\编于六点MCB细胞档案：（1）该细胞的历史——来源、动物年龄、性别、细胞分离的方法和所用的培养材料等。（2）细胞的特性——形态、生长的特性、种源特性、重组细胞的载体构建资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及稳定性等。（3）对各种有害因子检查的结果——细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括发转录病毒。目前三十四页\总数九十八页\编于六点

WCB中的细胞应该是从某个MCB的单一来源或者多个多个安瓿瓶融合在一起的，然后培养扩增到一定数量后，再分装贮存形成细胞库。WCB中的细胞也要建档案，并且要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。目前三十五页\总数九十八页\编于六点第四节动物细胞的培养条件和培养基保证细胞体外培养成功的基本条件：1.所有和细胞接触的设备、器材和溶液，必须保证无菌，避免细胞外微生物的污染；2.营养供应必须充足，绝对不能有有害物质，避免即使是极其微量的有害物质的渗入；3.保证适量的氧气供应；4.在培养过程中，随时除去细胞代谢产生的有害产物；5.保证适宜细胞生长的良好的外界环境；6.及时分种，保持适当的细胞密度。目前三十六页\总数九十八页\编于六点细胞培养的无菌操作二氧化碳细胞培养箱

目前三十七页\总数九十八页\编于六点一、动物细胞培养的条件1.器材的清洗和消毒细胞培养成功与否的重要因素之一就是培养细胞所用的器材和用具是否能做到彻底清洗和消毒。通过清洗和消毒去除影响细胞生长的有害物质，防止外来微生物的污染。目前三十八页\总数九十八页\编于六点（1）器材的清洗一般来说，器材的清洗主要有浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，确保器材上没有油迹和其他残留物质。浸泡有利于蛋白质和残留细胞等污垢的清除，常用3%磷酸三钠溶液，也可用一些常见的洗液；目前三十九页\总数九十八页\编于六点泡酸所用的酸有强酸和弱酸。新的玻璃仪器第一次使用前一定要用弱酸（稀盐酸）泡过，去除玻璃中的游离碱；强酸常用重铬酸钾和硫酸配制，利用其强氧化性去除仪器上不易洗脱的污渍。清洗干净的玻璃仪器要用清水反复冲洗干净，后分别用蒸馏水和去离子水冲洗。目前四十页\总数九十八页\编于六点（2）器材的消毒灭菌常用的灭菌方式有物理消毒和化学消毒。物理方法有紫外线、干热、湿热和过滤等；化学方法即使用抗生素和各种化学消毒剂。目前四十一页\总数九十八页\编于六点抗生素的使用要慎重，长期对同细菌、病毒使用同一种抗生素，很容易产生抗药性，而且抗药性很难消除，另外，抗生素的使用会影响到所培养细胞的生理代谢和形态。在实际生产中，为了避免污染、提高效益，抗生素经常使用，但是规定不得使用青霉素和β-内酰胺类抗生素（革兰氏阳性细菌）。实验室中常加的是青霉素和链霉素，简称双抗，防细胞污染。污染最多的是霉菌和真菌。目前四十二页\总数九十八页\编于六点培养器皿多孔板细胞培养瓶目前四十三页\总数九十八页\编于六点2.细胞培养的水质

水质的好坏直接影响细胞培养的成功与否。细胞培养的水必须进行特殊的处理，保证水中没有有毒元素、过量的金属离子和微生物污染。蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M以上。动物细胞制药用水，要求去热源。目前四十四页\总数九十八页\编于六点3.pH细胞量大时比细胞量小时对pH的耐受性强。动物细胞培养的最适pH为7.2-7.4，低于6.8或者高于7.6都会对细胞培养产生明显的不利影响。缓冲液系统，减少乳酸的影响。缓冲液：当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化的作用，称为缓冲作用，这样的溶液叫做缓冲溶液。弱酸及其盐的混合溶液（如HAc与NaAc），弱碱及其盐的混合溶液（如NH3·H2O与NH4Cl）等都是缓冲溶液。目前四十五页\总数九十八页\编于六点4.渗透压动物细胞有膜无壁，对外界环境渗透压的高低波动更敏感。原代细胞对渗透压的耐受性要比传代细胞差。细胞培养理想的渗透压为290-300mOsm/kg。mOsm：毫渗摩尔，1升溶液中所含的非电解质或电解质的毫摩尔数。调整溶液的渗透压常采用添加或减少NaCl的办法。目前四十六页\总数九十八页\编于六点5.温度温度过高导致细胞退变甚至死亡，温度过低会降低细胞的代谢和生长速度，影响产物的含量。

哺乳动物细胞的最佳培养温度是37±0.5℃昆虫细胞的最佳培养温度为25-28℃退变：因理化或生物作用而逐步老化变质直至损毁的过程。目前四十七页\总数九十八页\编于六点6.空气在细胞培养过程中必须供给足量的氧气，保证细胞进行能量代谢，减少培养过程中因为细胞糖酵解产生的乳酸积累，避免细胞的退变和死亡。在利用方瓶或者转瓶培养时，只要保证培养液的体积不超过培养瓶溶剂的30%，就可以利用瓶内空气保证培养所需而不需要额外通气；在采用生物反应器大量培养时，则必须专门通气，补充氧量。目前四十八页\总数九十八页\编于六点微生物细胞与动物细胞培养方法的比较性质微生物细胞动物细胞大小1-10μm10-100μm代谢调节方式内部内部和激素营养要求宽松，可利用多种底物苛刻生长速率倍增时间一般为0.5-2h倍增时间一般为12-60h机械强度较好很差，缺乏保护性细胞壁环境适应好差目前四十九页\总数九十八页\编于六点微生物细胞动物细胞PH控制添加酸、碱CO2-HCO3缓冲液搅拌速度速度快、范围广较慢溶氧控制改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度改变进入气体的氧浓度培养基灭菌方法高温蒸煮过滤培养时间几小时—几天几天—3、4周对水纯度的要求较低很高目前五十页\总数九十八页\编于六点二、动物细胞培养基的种类和组成培养基成分复杂而且昂贵是动物细胞工程制药成本较高的一个主要原因。动物细胞培养基主要分为三类：天然培养基合成培养基无血清培养基。目前五十一页\总数九十八页\编于六点1、天然培养基

在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。

天然培养基材料成分复杂、组分不稳定，来源有限，不适于大量培养和生产的需要。目前五十二页\总数九十八页\编于六点2.合成培养基

采用明确的化学试剂配制成的培养基。第一个合成培养基：199培养基。

合成培养基成分明确、组分稳定，可以大量生产。现阶段合成培养基种类繁多，在动物细胞培养中被普遍使用。目前五十三页\总数九十八页\编于六点合成培养基组分：（1）氨基酸。

不同培养基中氨基酸的种类和含量各不相同，至少含有细胞在生长过程中所必需的而又不能依靠自身合成的12种必须氨基酸，另外多有谷氨酰胺作为细胞生长的碳源和能源物质。动物细胞只能利用L型氨基酸，在配制时必须采用L型同分异构体。（2） 维生素

用于维持细胞生命活动的低分子活性物质，常作为辅酶或辅基。细胞自身基本不能合成维生素，必须从培养基中摄取。目前五十四页\总数九十八页\编于六点（3）糖类，细胞生长的碳源和能源物质。（4） 无机盐保持细胞的渗透压，缓冲pH的变化，并积极参与细胞的代谢（NaCl、KCl等），CuSO4、ZnSO4等可以促进细胞的代谢。（5）其他成分，在培养基中加入一些核酸的前体及氧化还原剂。目前五十五页\总数九十八页\编于六点市售动物细胞合成培养基目前五十六页\总数九十八页\编于六点为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，常在培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，对血清的要求更高，常用10~20%的胎牛血清。培养用血清目前五十七页\总数九十八页\编于六点添加血清培养动物细胞的作用：①为细胞生长提供有利其增殖的各种生长因子和激素。②提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子。③提供细胞识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白。④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。⑤提供良好的pH缓冲系统。目前五十八页\总数九十八页\编于六点3.无血清培养基无血清培养基的优点：①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。目前五十九页\总数九十八页\编于六点无血清培养基是在合成培养基的基础上加入一些添加剂，添加的物质主要有：①激素和生长因子；②结合蛋白；③贴附和伸展因子；④其他有利于细胞生长的因子和元素。德国PAN牌CHO细胞无血清培养液PANSERIN604S，培养基不含不明确的溶解产物和任何植物水解产物,不含任何蛋白质。没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。目前六十页\总数九十八页\编于六点第五节动物细胞培养的基本方法一、细胞培养的分类培养细胞的种类：原代培养、传代培养培养基的不同：液体培养、固体培养培养容器的方式：静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定化培养目前六十一页\总数九十八页\编于六点二、细胞培养的基本技术1细胞分离①离心分离法：主要用于从含有细胞体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞，一般用800-1000r/min离心5~10min②消化分离：用消化液消化取自生物体的组织块，使组织松散成细胞悬液，再经洗涤、分离得到所需细胞。

常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA、或胰酶-EDTA联用及胰酶-柠檬酸盐。目前六十二页\总数九十八页\编于六点2.

细胞计数：细胞分离制备成悬液准备接种时需进行细胞计数。细胞计数方法：①自动细胞计数器计数：电子细胞自动计数器，计数速度快，但无法分辨死、活细胞。全自动细胞计数分析仪目前六十三页\总数九十八页\编于六点②血球计数板计数：计数时细胞染色，可分辨死、活细胞。

将细胞悬液进行适当的稀释，然后吸取少量的稀释后悬液滴于计数板上盖玻片一端，让液体填满盖玻片下方间隙，不要产生气泡，稍静置几分钟在显微镜下观察并计算四角大格内的细胞数，细胞压线只计算压上线和右线的，然后利用公式：

每毫升细胞数=4大格中细胞总数/（4×10000×稀释倍数）上面公式中分母乘以10000是因为四角每一个大格面积为1mm2，盖玻片和计数板之间的间隙为0.1mm，所以每一个大格内容积为0.1mm3，要计算1ml悬液的细胞数就要扩大10000倍。

可以通过染色的方法区别细胞的死活。常用的染色剂有：①台盼蓝，是一种细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性。还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。②苯胺黑，色较台盼蓝深，有毒。目前六十四页\总数九十八页\编于六点血细胞计数板目前六十五页\总数九十八页\编于六点③结晶紫染色细胞核计数

结晶紫染色液具有低渗作用，使细胞分散解离和破碎，将细胞核染成蓝色，镜下对细胞核计数。微载体细胞培养中使用。④MTT染色计数细胞内线粒体脱氢酶将MTT（四甲基偶唑盐，蓝色）转变为不可溶性的紫色结晶（甲臜）。目前六十六页\总数九十八页\编于六点3细胞传代

细胞生长至一定时期时会产生接触抑制现象，不能无限生长，若细胞不及时分种，细胞就会死亡、脱落。悬浮细胞的传代：加入1倍或几倍的生长液，然后分种两只或多个培养瓶。贴壁细胞的传代：需经消化液消化后再分种。目前六十七页\总数九十八页\编于六点（1）要确保需消化的细胞无污染；（2）加入消化液适量，以摇动时能盖满单层细胞为宜；（3）消化时间要适量，一般室温2-5分钟，细胞层出现网孔时即可停止；（4）终止消化要先去掉消化液，再加入含血清的培养基；（5）分种数取决于细胞数和细胞特性，一般20万-30万个/ml，每次1传2或1传3为宜；（6）已培养过的瓶子可再次使用，但不要超过2-3次；（7）传代细胞培养时必须标明传代次数；（8）传代后1-2天更换培养液，3-5天传代一次。贴壁细胞分种的主意事项：目前六十八页\总数九十八页\编于六点4.细胞的冻存和复苏（1）细胞的冻存细胞的冻存常采用液氮低温冻存，在冻存过程中需加入适量甘油或二甲基亚砜作为保护剂。如采用冷冻方法冻存要注意冷冻速度的把握，温度下降以1℃/min为宜。目前六十九页\总数九十八页\编于六点细胞冻存过程中需注意：①冻存的细胞需处于良好的状态；②细胞密度以1×106~2×106/ml为好；③配置冻存用的培养基要与实际使用的一致。④冻存管或瓶要注意密封；⑤冻存管标签上标明细胞名称、编号、冻存日期，最好在外面再贴一层透明胶布。（2）细胞的复苏细胞复苏总得要求是快融。目前七十页\总数九十八页\编于六点复苏细胞、接种细胞、保存细胞目前七十一页\总数九十八页\编于六点第六节动物细胞的大量培养的方法和操作一、动物细胞大规模培养的方法1.悬浮培养让细胞自由的悬浮于培养基内生长增殖，适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。操作简便，培养方法均一，传质和传氧好，容易扩大培养规模，培养出的细胞密度较低。目前七十二页\总数九十八页\编于六点2.贴壁培养让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法，适用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。这种培养方法的优缺、点同悬浮培养正好相反。目前七十三页\总数九十八页\编于六点3.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）将悬浮培养和贴壁培养的优点结合在一起而成贴壁-悬浮培养。（1） 微载体培养，利用小颗粒载体使贴壁细胞附着其上培养增殖，而载体体积小、比重轻，在轻度搅拌下就可携带附着其上的细胞悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点，又能提高细胞密度。目前七十四页\总数九十八页\编于六点理想的微载体要有如下特征：①载体表面性质同细胞有良好的相容性，适于细胞的附着、伸展和增殖；②微载体材料无毒性；③微载体材料不与培养基成分发生化学变化，也不吸收培养基中养分；④微载体比重要适中；⑤微载体体积匀称、均一，利于细胞均匀分布；⑥具有良好的光学透明性，易于镜下观察；⑦微载体基质最好为软性的；⑧可耐120℃高温；⑨处理后可反复使用；⑩原料充分，制作简便，价廉。目前七十五页\总数九十八页\编于六点（2） 包埋和微囊培养，将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内培养，包埋的凝胶载体较大，此法又称为巨载体培养。（3）结团培养，以细胞本身作为基质，使其相互贴附后再用悬浮的方法进行培养。目前七十六页\总数九十八页\编于六点二、动物细胞的培养的操作方式1.分批式培养操作两种操作方法：

①将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，细胞不断增长、产物不断形成、积累，最后将细胞和培养基一并取出，结束培养；

②先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，在反应器中加入诱导剂或病毒等，作用一段时间后，将反应物取出。目前七十七页\总数九十八页\编于六点2.半连续性培养操作当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物的形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物（条件培养基或附着在载体上），然后补充同样数量的新鲜培养基或载体，继续培养。目前七十八页\总数九十八页\编于六点3.灌流式培养操作

当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将一部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。优点：（1）培养条件稳定、营养条件好、有害代谢废物浓度低；（2）极大的提高细胞密度；（3）产品在培养罐内时间缩短，可及时低温保存，提高产品质量；（4）培养基比消耗率降低，降低成本。目前七十九页\总数九十八页\编于六点第七节动物细胞生物反应器动物细胞生物反应器是给动物细胞的生长代谢提供一个最优化的环境，从而使其在生长代谢过程中产生出最大量、最优质的所需物质。理想的动物细胞生物反应器应该具有如下特征：（1）制造生物反应器所需要的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的；（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能；目前八十页\总数九十八页\编于六点（3）密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染；（4）对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调解控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一；（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤为重要（6）容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积；（7）拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修；（8）设备成本尽可能低。实验室规模——20L中试规模——20-100L生产规模——100L。目前八十一页\总数九十八页\编于六点一、动物细胞生物反应器的类型及基本结构生产中常用的细胞生物反应器有：搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器等。目前八十二页\总数九十八页\编于六点1.搅拌罐式生物反应器

搅拌罐式生物反应器是通过借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器，是目前大规模动物细胞培养的主要生产设备。

（1）罐体的高径比一般采用1~1.5：1，利于增大与空气的接触面；培养动物细胞的罐底为圆形，以避免细胞和载体沉积在周边；（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20~100r/min，故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器；（3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的作用力力对细胞的损伤；（4）从高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。特点：目前八十三页\总数九十八页\编于六点2.气升式生物反应器

利用气体通过装在罐底的喷管进入反应器的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体密度，而使液体形成循环流，循环方式有内循环式和外循环式。目前八十四页\总数九十八页\编于六点溶氧:通过自动调节进入空气的速率来控制；pH值：可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。

同搅拌式生物反应器相比，气升式生物反应器具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，而且由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价，其高径比一般在10：1左右。目前八十五页\总数九十八页\编于六点3.中空纤维式生物反应器途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转。中空纤维反应器示意图细胞培养基入口培养基出口空气与CO2出口空气与CO2入口

中空纤维式生物反应器占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低；其不足之处在于：①不能重复使用；②不能耐受高压灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌；③难以取样检测目前八十六页\总数九十八页\编于六点4.透析袋或膜式生物反应器在动物细胞培养过程中，会产生一些代谢产物，如乳酸和氨等，对细胞的生长和产物的产生会产生抑制作用，透析袋或膜式反应器可将这些有害代谢产物透析或过滤掉，从而使细胞生长至更高密度，同时可根据需要选用不同相对分子质量的膜，使产物保留在膜内或与细胞分离开。目前八十七页\总数九十八页\编于六点5.固定床或流化床式生物反应器固定床结构简单、装填的材料多样且相对固定，只要是对细胞无毒又有利于细胞贴附的材料（不锈钢、玻璃杯、玻璃珠、光面陶瓷、塑料等实心载体或有孔的陶瓷、玻璃和聚氨基塑料等）皆可利用。固定床生物反应器通常填装材料体积较大，导致反应器内细胞因营养物质和氧的交换不够充分而影响生长和代谢，所以渐减小填充载体，演化为流化床生物反应器。目前八十八页\总数九十八页\编于六点气体交换氧气回流收获营养液泵反应塔加热器PH传感器TDOCO2生产用CF-IMMOTM流化床生物反应器示意图①传质性能很好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物；

②反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不会损坏脆弱的细胞，既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。③可实现高密度细胞培养、使高产量细胞长时间停留在反应器中、优化细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求。目前八十九页\总数九十八页\编于六点二、动物细胞生物反应器的检测控制系统1、培养过程中需检测的物化参数细胞培养可选择不同的反应器，但培养过程中需检测的参数大致相同。

在线检测的参数：温度、pH、搅拌速度、溶氧等；

取样离线检测的参数：如活细胞数、氨基酸浓度分析、葡萄糖、乳酸和铵离子的检测等；

检测后计算获得的参数：如细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等。目前九十页\总数九十八页\编于六点2.主要参数的检测和控制方法在动物细胞培养中，温度、pH、溶氧、转速和进出液流量等几个参数最为重要。（1）温度，常用于检测反应器温度的是电阻温度计。（2）pH，复合式参比电极。（3）溶氧，极谱式或电流式覆膜电极。（4）搅拌，人工设定和调解控制及电磁感应技术。（5）进出液流量，通过对培养液泵进出的速度控制。（6）其他，罐压、液位、O2和CO2浓度等。