上海市临检中心 PCR技术人员上岗培训班课件 NIPT实验室检测及质量控制-徐晨明 【兼容模式】

NIPT实验室检测及质量控制徐晨明上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院NIPT介绍检测技术流程检测质量控制质量控制指标NIPT介绍母血胎盘无创产前筛查，NIPT(Non‐Invasiveprenatal

testing):利用高通量测序技术，检测母体血浆中的胎儿游离DNA来筛查胎儿染色整倍体异常的技术，主要针对21、18、13染色体。胎儿DNA母亲DNA游离DNA发展史1947年外周血中发现游离DNA2011年NIPT临床应用1997年胎儿游离DNA的发现1987年恶性肿瘤患者血浆中分离出游离2007年NIPT方法学的建立DNA（cf-DNA）将提取到的血浆／血清的DNA，用Y染色体特异性引物扩增，扩增后的产物凝胶电泳后观察条带。13、14号为男性基因组，阳性对照，15号为未怀孕女性基因组，阴性对照。可见怀孕的女性血浆里可以检测到男性胎儿的DNA胎儿游离DNA特点来源：z

胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；z

胎儿细胞凋亡；z

胎盘滋养层细胞凋亡。基本特点：‹

含量有一定的变化规律。妊娠第5周开始可检测到胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，但存在个体差异；‹

分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min，2h后无法检出；‹

DNA片段较小，平均166bp左右。Am.

J.

Hum.

Genet.

62:768–775,

199同传统化学法唐氏筛查的比较NIPT0.3%0.2%检测指标传统唐筛3.6%假阳性率（21三体）假阳性率（18三体）0.6%阳性预测值（21三体）45.5％4.2%阳性预测值（18三体）40.0%8.3%同时NIPT的阴性预测率100%(95%置信区间,99.8至技术优势目前报道的检出率：21‐三体（唐氏综合症）

(99.0%),

18‐三体综合症

(96.8%)和13三体综合征

(92.1%)The

new

england

journal

of

medicine

报道的假阳性比率检测技术流程检测技术流程样本信息采集数据分析样本接收上机测序跟踪回访血浆分离DNA提取文库构建QC文库检测报告生成和发放血浆分离&DNA提取&文库构建全血4℃，1600g离心10min，取上清血浆血浆4℃，16000g离心10min，取上清血浆不同的测序平台加接头的方式会有差异如果使用一步离心的话转速过低将不能很好的将游离DNA分离出来，相反过高的又会造成细胞破裂增加背景。QC文库检测文库质量检测常用的检测仪：PCR定量检测仪：对文库的浓度定量，定量准确，如果测序仪对浓度的容忍度低建议使用此定量方法，但是不能检测片段长度。建议配合片段长度检测仪一起使用。100/2200生物分析仪：既可以检测文库的浓度又可以检测文库的片段长度。但文库浓度定量没有QPCR定量准确。如果测序仪对浓度的容忍高建议使用此定量方法。2100检测仪7500荧光定量PCR仪Qubit浓度检测仪ubit浓度检测仪：对文库的浓度定量，浓度误差大，成本较前两种低。如果是熟练稳定的建库同时测序仪对浓度的容忍度高的，可以使用此种方法。上机测序半导体测序是过模板珠实现而模板珠是落刚好能容纳一珠子的微孔中行反应的。测时适用聚合酶行聚合反应，间每一个反应段加入一种碱一旦加入的碱可以进行聚合应，即释放出离子，使孔槽的PH值产生变边合成边测序技术是通过测序过程中加入的碱基所带的荧光的不同，经拍照记录颜色的不同来判断碱基的差异。数据分析以21‐三体为例，假设：100

DNA单位

/毫升血浆。其中,95个单位来源于母亲,

5

个单位来源于胎儿通过大规模并行测序,获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量,经

过计数与比较:

正常胎儿或者

21‐三体胎儿报告生成和发放报告内容：21,18,13三体风险评估建议：“高风险”的孕妇，须进一步进行产前诊断，“低风险”的孕妇，需进行后续随诊。检测质量控制检测前唯一标识、申请检测的项目临床信息检测申请样本采集采样前准备、采集信息收集（日期、样本类型）、采血管、样本体积≥5mL血浆：干冰、

cell

free

DNA采血管全血

：常温样本运输及保存标本接收接收标准、拒收；不合格样本的记录检测申请适用人群不适用人群孕周<12＋0周血清学筛查显示胎儿常见染色体非整倍体风险值介于高风险切割值与1/1000之间的孕妇夫妇一方有明确染色体异常1年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗等有介入性产前诊断禁忌证者（如先兆流产、发热、出血倾向、慢性病原体感染活动期、孕妇Rh阴性血型等）胎儿超声检查提示有结构异常须进行产前诊断有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险孕期合并恶性肿瘤孕20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间，但要求评估21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征风险者医师认为有明显影响结果准确性的其他情形注：本标准选自卫计委《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》样本采集采血管类型编号要同采血管上一致EDTA管采样体积≧5mlCell

freeDNA

管样本运输及保存样本体积样本类型运输条件备注4℃下条件暂存，必须离体8小时内4℃条件下进行血浆分离。母体全血（EDTA管）5‐10mL4

℃采血管或送检单上标记抽血日期及时间。全血离体72小时内

4

℃条件下进行血浆分离。母体全血（cell

freeDNA

采血管）10

mL6‐35

℃环境下常温运输血浆分离后短期（一周内）可以在﹣20℃冰箱暂存，长期‐80

℃条件保存，避免反复冻融；禁止将样本置于室温下放置，避免反复冻融。血浆≧2

mL干冰标本接收标本拒收情况标本采集不当，如抗凝剂使用不正确、容器使用不正确、严重溶血或有血凝块、采血管破裂或开盖、标本标识不清等标本未按照规定的温度、时限等保存和运输检测申请单填写不完整溶血溶血正常检测中每个标本有效数据量、唯一比对序列数目等均应当符合试剂说明书要求

；检测质量合格的标本应当严格按照产品说明书进行实验室结果判读EDTA：8h、Streck：72h血浆标本-70℃以下保存文库构建上机测序血浆分离DNA提取文库质控信息分析防止混样及DNA污染文库的片段大小和浓度要符合试剂说明书要求检测中信息分析DataUsable

DataAnalysisResult数据测序质控数据In‐Run质控数据分析质控检测中无创产前检测PCR实验室分区及各区的环境要求分

区主

要

功

能温

度湿

度

压

差试剂准备区18-27℃30-70%+15PA试剂准备、储存与分装标本与文库制备区血浆分离与提取，文库构建18-27℃30-70%+5PA文库扩增与检测区文库扩增、质检与混合（pooling）18-27℃30-70%-5PA-15PA20-25℃40-60%测序区测序检测检测中仪器及设备维护状态标识确认正常确认仪器的性能符合测试要求••按要求进行日常维护维护记录故障限制使用12345期间核查校准及验证安装••安装、调试使用授权定期校准••功能核查记录••记录校准日期、结果、到期期限及下次校准的时间检测后报告应包含的内容（样本信息、采集唯一性标识、患者信息、检测信息、结果及解释等）确认检测结果与患者临床信息的一致性结果报告报告发放跟踪回访报告按时发放，高风险结果及时通知采集者生产后进行产后胎儿状况的跟踪回访，并做好记录质量控制指标能力验证(室间质评）卫生部临检中心组织的室间质评参加室间质评的注意点：1.

检验全过程（包括检测前、检测中）2.在能力验证活动截至日期前，实验室间不能进行与能力验证结果相关的沟通3.能力验证的样本检测方法及流程应与日常临床样本检验要求一致4.保证所有人员都有机会能参与5.检测结果将由组织方、监督方或指定机构评定质量控制指标21三体综合征检出率不低