UT对PQ中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用研究

UT对PQ中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用研究目前一页\总数二十三页\编于十七点研究背景-百草枯简介百草枯(paraquat,PQ)，20%，250mL装；是一种有机杂环类广谱非选择性接触性除草剂及脱叶剂。PQ对人畜具有较强毒性，人口服致死量约为1～3g。中毒后致急性肺损伤及肺纤维化改变为其特异表现缺少特效解毒剂和能够在血液或组织中与PQ结合的螯合剂，PQ中毒的病死率高达60%～80%。目前二页\总数二十三页\编于十七点研究背景-乌司他丁简介乌司他丁

(Ulinastain

,UT)，本品是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量约6700。本品属蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用。另具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子（MDF）产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。

目前三页\总数二十三页\编于十七点研究背景-肺成纤维细胞正常情况下，MRC-5存在精确调控，分泌的细胞外基质（ECM）处于动态平衡。胶原蛋白是主要的ECM蛋白，占肺干重1/5（Ⅰ、Ⅲ）。肺损伤后，MRC-5及胶原蛋白过度合成，参与病理修复。胶原蛋白的生成和沉积将导致肺纤维化目前四页\总数二十三页\编于十七点肺成纤维细胞炎症介质百草枯细胞因子力学刺激缺氧肺成纤维细胞目前五页\总数二十三页\编于十七点研究背景-结缔组织生长因子（CTGF）CTGF属于TGF-β家族，作为TGF-β的下游因子，主要促进细胞增殖、粘附，ECM异常沉淀早期即刻蛋白，主要表达于活化的肺纤维细胞，见于肺纤维变性早期，晚期极弱。可作为纤维化病变早期诊断标志物。促纤维化作用呈剂量依赖，可被抗CTGF抗体拮抗。目前六页\总数二十三页\编于十七点研究背景-细胞力学特性力学特性（粘弹性）是细胞的一种本质属性，细胞所处的生理/病理状态、组织环境和力环境不同，所表现的力学特性也不尽相同。解释一些组织器官的生理、病理变化以及解释疾病的发病与治疗机理等具有重要的意义。目前为止，国内外尚未见有关百草枯中毒过程中肺成纤维细胞生物力学特性变化的报道。目前七页\总数二十三页\编于十七点前期工作

课题组在这方面已有一定的工作基础。部分工作人员，曾在吉林省科技发展计划项目（20100138）百草枯致中毒性肺纤维化发病机理的力学生物学研究的支持下，研究了百草枯致中毒后短时间内肺成纤维细胞的CTGF的表达、细胞增殖情况及细胞粘弹性的变化等，实验结果表明百草枯影响了细胞的生物学特性和生物力学特性。并已发表文章2篇。

1.GuohuiWang，YongpengXie，DanShi，NanZhang.TheEffectsofmechanicalstimulationonproliferationandCTGFexpressionofhumanlungfibroblast.The4thInternationalConferenceonImageandSignalProcessing,(2011年10月发表，EI收录)2.GuohuiWang，YongpengXie，NanZhang.TheStudyofCTGFExpressionofLungFibroblastsAfterTreatedbyParaquat，第十六届亚太呼吸年会.(2011年11月发表，SCI收录)目前八页\总数二十三页\编于十七点人胚肺成纤维细胞MRC-5Olympus倒置相差显微镜:培养皿中细胞正常生长，形态呈长梭形。

目前九页\总数二十三页\编于十七点百草枯处理前后MRC-5细胞显微图片

A：正常MRC-5细胞

B：50mg/LPQ培养液处理后

C：100mg/LPQ培养液处理后

D：200mg/LPQ培养液处理后

目前十页\总数二十三页\编于十七点

PQ对MRC-5CTGF表达的影响

各组细胞CTGF浓度比较（*P<0.05）

目前十一页\总数二十三页\编于十七点PQ对MRC-5生物力学特性影响肺成纤维细胞在30mm水柱负压下吸入长度随时间变化情况目前十二页\总数二十三页\编于十七点PQ对MRC-5生物力学特性影响经过PQ处理后MRC-5细胞的粘弹性各项参数均明显小于正常MRC-5细胞也就是说经过PQ处理后的MRC-5生物力学特性降低，变得较“软”在经过100mg/L和200mg/L百草枯处理后MRC-5粘弹性要小于50mg/L而100mg/L和200mg/L百草枯处理组之间细胞的粘弹性无明显差异各组细胞粘弹性参数比较

目前十三页\总数二十三页\编于十七点实验目的

通过实验研究乌司他丁对百草枯中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用，得到乌司他汀对百草枯致肺损伤的治疗效果及治疗原理。

目前十四页\总数二十三页\编于十七点实验内容应用乌司他汀注射液处理经不同浓度百草枯损伤的肺成纤维细胞，检测细胞CTGF的表达及细胞的粘弹性，说明乌司他汀对百草枯中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用，研究乌司他汀对百草枯致肺损伤的治疗效果并解释其治疗原理。目前十五页\总数二十三页\编于十七点试验器材仪器及材料

细胞：人胚肺成纤维细胞MRC-5，中科院细胞库。试剂：胎牛血清培养基、胰蛋白酶、CTGFELISA试剂盒。主要仪器：二氧化碳培养箱、高低速离心机、微管吸吮系统、流式细胞仪、ELx-800NB酶标仪及配套洗板机等。目前十六页\总数二十三页\编于十七点微管吸吮系统

本实验我们采用微管吸吮技术检测肺成纤维细胞在一定负压下吸入长度随时间的变化，结合标准线性固体粘弹性模型得到了正常及百草枯处理后肺成纤维细胞的生物力学特性（粘弹性参数），研究百草枯对人肺成纤维细胞生物力学特性的影响。目前十七页\总数二十三页\编于十七点试验方法

1.用含不同浓度百草枯的细胞培养液（50mg/L、100mg/L、200mg/L）处理常规培养的肺成纤维细胞12h。12h后换含乌司他丁的细胞培养液继续培养，在乌司他丁处理后0h、12h、24h、36h、48h获取细胞进行检测。2.通过PCR技术及酶联免疫吸附试验技术检测肺成纤维细胞CTGF的表达。3.结合标准线性黏弹性模型，采用微管吸吮技术测试细胞的力学特性（粘弹性参数）

目前十八页\总数二十三页\编于十七点技术流程图

肺成纤维细胞的常规培养不同浓度百草枯处理细胞12h不同浓度乌司他汀处理细胞0h、12h、24h、36h、48h获取细胞PCR及ELISA法检测CTGF的表达微管吸吮技术检测细胞粘弹性乌司他汀对百草枯中毒后损伤肺成纤维细胞的修复作用及治疗肺损伤的机理目前十九页\总数二十三页\编于十七点拟解决的技术难题

第二

第三步第一选择合适的力学刺激（波形、拉伸幅度、频率、时间），模拟在体肺细胞的力学环境，对人胚肺成纤维细胞进行体外力学环境培养；选用合适的百草枯剂量处理人胚肺成纤维细胞；并选择合适的乌司他汀治疗剂量处理中毒的人胚肺成纤维细胞。对实验结果从生物学-医学-力学角度进行综合分析目前二十页\总数二十三页\编于十七点拟采集数据结果UT对PQ处理后MRC-5增殖的影响

UT对PQ处理后MRC-5CTGF表达的影响

UT对PQ处理后MRC-5生物力学特性影响

目前二十一页\总数二十三页\编于十七点创新点a.从细胞层次来研究乌司他汀治疗百草枯致肺损伤的效果及治疗原理。b.根据细胞CTGF的表达及细胞粘弹性的变化来说明细胞的损