《生物技术概论》教案与讲义

《生物技术概论》课程讲义与教案

杜志强

2010年8月

第一章生物技术总论

一、生物技术的含义：

生物技术是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科，采用先进的工程技术手

段，按照设计改造生物体或生物原料，为人类生产出所需要产品或达到某种目的。

(1)现代生命科学：目前，普遍认为现代生命科学系统的建立开始于16世纪。它的基

本特征是人们对生命现象的研究牢固地植根于观察和实验的基础上。

(2)先进的工程技术手段：是指基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工

程。

(3)生物原料：指生物体的某一部分或生物生长过程中产生的能利用的物质，如淀粉、

纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。

(4)目的：包括疾病的预防、诊断与治疗，食品的检验、环境污染的监测和治理等。

二、生物技术的种类及其相互关系：

1、生物技术种类。

(1)传统生物技术：指旧有的制造酱、酒、面包、奶酪、酸奶及其它食品的传统工艺。

(2)现代生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程。

2、五大工程间的关系。

基因工程是核心，带动其他四大工程的发展，四大工程的发展又促使基因工程发展更迅

猛。基因工程和细胞工程看作生物工程的上流处理技术，将发酵工程和酶工程看作生物工程

的下流处理技术。基因工程、细胞工程和发酵工程中所需的酶往往是通过前工程来获得的。

3、生物技术涉及学科。

现代生物技术以分子生物学、细胞生物学等几乎所有生物科学次级学科为支撑，又结合

了化学、化学工程学等生物学领域之外的尖端基础学科，从而形成一门多学科相互渗透的综

合性学科。

目前生物技术相关的行业可分为：疾病治疗、检测与诊断、大农业、食品、环境、能源、

化学品、设备八大类型。

4、生物技术的基本特征。

(1)高效益，可带来高额利润。

(2)高智力，具有创造性和突破性。

(3)高投入，前期需要投入大量资金。

2

（4）高竞争，时效性的竞争非常强烈。

（5）高风险，高竞争带来高风险。

（6）高势能，对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响，具有很强的渗透性和

扩散性。

三、生物技术发展简史：

（-）传统生物技术。

从史前时代起就一直为人们所开发和利用。在石器时代后期，我国人民就会利用谷物造

酒，这是最早的发酵技术。在公元10世纪，我国就有了预防天花的活疫苗。在西方，苏美

尔人和巴比伦人在公元前6000年就已开始啤酒发酵。埃及人则在公元前4000年就开始制作

面包。1676年，荷兰人Leeuwenhoek（1632〜1723）制成了能放大170〜300倍的显微镜,

并首先观察到了微生物。

19世纪60年代，法国科学家L.PasteurC1822~1895）首先证实发酵是由微生物引起的，

并首先建立了微生物的纯种培养技术。

匕世纪20年代，工业生产中开始采用大规模的纯种培养技术发酵化工原料丙酮、丁醇。

50年代，在青霉素大规模发酵生产的带动卜，发酵工业和酶制剂工业大量涌现。发酵技术

和酶技术被广泛应用于医药、食品、化工、制革和农产品加工等部门。

本世纪初，遗传学的建立及其应用，产生了遗传育种学，被誉为“第一次绿色革命”。

细胞学的理论被应用于生产而产生了细胞工程。

在今天看来，上述诸方面的发展，还只能被观为传统的生物技术，因为它们还不具备高

技术的诸要素。

（-）现代生物技术。

现代生物技术是以70年代DNA重组技术的建立为标志的。1944年Avery阐明了DNA

是遗传信息的携带者。1953年Waltson和Crick提出了DNA的双螺旋结构模型，阐明了DNA

的半保留复制模式，从而开辟了分子生物学研究的新纪元。1961年Khorana、Nirenberg破

译了遗传密码，揭开了DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密。

1972年Beng首先实现了DNA体外重组技术，标志着生物技术的核心技术——基因工

程技术的开始。它向人们提供了一种全新的技术手段，使人们可以按照意愿在试管内切割

DNA、分离基因并经重组后导人其他生物或细胞，藉以改造农作物或畜牧品种；也可以导

人细菌这种简单的生物体，由细菌生产大量的有用的蛋白质，或作为药物，或作为疫苗；也

可以直接导人人体内进行基因治疗。显然，这是项技术上的革命。以基因工程为核心，带

3

动了现代发酵工程、现代酶工程、现代细胞工程的发展，形成了具有划时代意义和战略价值

的现代生物技术。下图是针对苏格兰羊的转基因技术：

乳细

腺

的

胞

中

体

倍

双

入

植

核

卵

核

去

中

四、生物技术对社会经济的影响：

（-）改善农业生产、解决食品短缺。

1、提高农作物产量及其品质。

（1）培育抗逆的作物优良品系：第一株转基因植物：1982年美国和比利时的学者，分别把

细菌中抗碘那霉素基因转入向日葵，烟草和胡萝卜的细胞中，使这些植物的抗药性提高八倍

多。

（2）植物种苗的工厂化生产。

我国已建立了多种植物试管苗的生产线，如葡萄、苹果、香蕉、柑橘、花卉等。

（3）提高粮食品质。

美国威斯康星大学的学者将菜豆储藏蛋白基因转移到向日葵中，使向日葵种子含有菜豆

储藏蛋白。

（4）生物固氮，减少化肥使用量。

（5）生物农药，生产绿色食品。

2、发展畜牧业生产。

（1）动物的大量快速无性繁殖。

4

1997年2月英国Roslin研究所用绵羊乳腺细胞培育出一只小羊——"多莉"。这意味着

动物体细胞同样有可能进行动物的大量、快速无性繁殖。

（2）培育动物的优良品系。

第一例转基因动物：1980年美国华盛顿大学和宾西法尼亚大学的学者，把大老鼠的生

长激素基因与小老鼠的一段基因拼接在一起组成一个重组体，把这个重组体注射到小老鼠的

受精卵里，再把受精卵移植到借腹怀胎的雌鼠体内，生下的小鼠其生长速度比普通小鼠的平

均生长速度快50%。此外，还有采用基因打靶技术培育转基因克隆羊、利用乳腺生产药用

蛋白的转基因羊、用于人体器官移植的转基因猪。

（-）提高生命质量，延长人类寿命。

1、开发制造奇特而乂贵重的新型药品。

1977年11月，美国人工方法化学合成了人生长激素释放抑制素基因。美国首先采用大

肠杆菌生产了人类第一个基因工程药物——人生长激素释放抑制激素。

此外，还开发了人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗

血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等。

2、疾病的预防和诊断。

（1）1998年初，美国食品和药物管理局（FDA）批准了首个艾滋病疫苗进入人体试验。

（2）DNA探针，主要用来诊断遗传性疾病和传染性疾病。

（3）1975年，英国科学家米尔斯坦利用细胞融合技术将一个B型淋巴细胞，和个骨髓瘤

细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞，其产生的抗体叫做单克隆抗体。

3、基因治疗。

（1）1990年9月，美国FAD批准了用ADA（腺背脱氨酶）基因治疗严重联合型免疫缺陷病

（一种单基因遗传病），并取得了较满意的结果。

（2）从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。

5

匚.牛泌乳基因e

5I“|3'

3"=15'

人tPA基因

重组/A基因

将或组［小基因注入

+羊受精卵的细胞核

把受精卵殖入羊的子宫

4,人类基因组计划（HGP）。

1986年美国生物学家诺贝尔奖获得者Dulbecc。首先倡议，全世界的科学家联合起来从

整体上研究人类的基因组，分析人类基因组的全部序列以获得人类基因所携带的全部遗传信

息。毫无疑问，该项工作的完成，将使人们深入认识许多困扰人类的重大疾病的发病机理；

90年代的人类基因组计划的科学意义如同60年代的登月计划。所以继美国之后，欧盟国家、

日本、俄罗斯、加拿大、澳大利亚和我国也相继启动了人类基因组计划。

1990年开始启动，计划15年内完成人类全部基因组30亿个碱基对的排列顺序的测定

和图谱分析。即把人体内十万个基因所在的位置确定下来，把基因分离出来，研究其功能，

认识基因和疾病的关系。

一般把找到的基因称为靶基因。基因治疗就是对相关的基因进行抑制或调整。所有的药

物开发，是先在靶基因上实验的。因此有了基因，就可以制造基因工程诊断试剂，基因工程

治疗药物，甚至形成治疗这种疾病的药物产业。

6

（三）解决能源危机、治理环境污染。

（四）制造工'业原料生产贵重金属。

利用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多。概括起来，

主要有以下几个大类：①氨基酸类：主要的有谷氨酸（即味精）、赖氨酸等；②酸味剂：主

要有柠檬酸、苹果酸等.③甜味剂：主要有天冬甜精（甜味是砂糖的2400倍）、氯化砂糖（甜

味是砂糖的600倍）。发酹技术还可用来生产化学工业原料。主要有传统的通用型化工原料

如乙醇、丙酮、丁醇等产品。在冶金工业方面，高品位富矿不断耗尽。面对数量庞大的废渣

矿、贫矿、尾矿、废矿，采用一般的采矿技术已无能为力，惟有利用细菌的浸矿技术才能对

这类矿石进行提炼。可提取的金属包括金、银、铜、铀、镒、钥、锌、钻、银、钢、铭等

10多种贵重金属和稀有金属。

（五）生物技术的安全性及其对伦理、道德、法律的影响。

7

第二章基因工程

第一节基因工程概论

一、基因工程的含义：

应用人工方法把生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重

组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使

新的遗传信息在新的宿主或个体中大量表达，以获得基因产物。这种通过体外DNA重组创

造新生物并给予特殊功能的技术。

基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。具体如下所示：

。基因工程的别名：基因拼接技术或DNA重组技术

操作环境：生物体外

操作对象：基因

操作水平：DNA分子水平

基本过程：剪切一拼接f导入f表达

I结果：人类需要的基因产物

二、基因工程研究的理论依据

1、不同基因具有相同的物质基础。

地球上的几乎所有生物的基因都是一个具有遗传信息的特定核甘酸序列的DNA片段，

而所有生物的DNA的组成基本结构都是一样的，从而使得不同生物间进行基因重组互换是

可能的。

2、基因是可以切割的。

可以采用特定的限制性核酸内切能对基因进行人为切割。

（1）限制性核酸内切酶EcoRI的酶切位点：

来源：主要从原核细胞分离。

作用：•种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核甘酸序列，并且使每条

链中特定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）。

8

结果：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核甘酸，他们之间正好互补

配对，这样的切口叫黏性末端。

（独性末端）

（2）其他几种限制性核酸内切酶的酶切位点:

K

日

口

口

口

oEarHs门

uTwu121

口

口

口

用

口

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M日

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K

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口■

MnQ口

mW30mM目

3、基因是可以转移的。

基因可以在同•染色体上转移（转座子），可以在不同染色体间转移（重组），也可在人

为条件下在不同物种之间转移（转基因）。

4、多肽与基因之间存在对应关系。

一酶一基因理论（onegene/oneenzymehypothesis）的不足之处：

（1）有些醐不是由一条肽链组成；

（2）有些基因编码的肽链不是酶；

（3）有些基因的产物是RNA,不是Pro。

5、遗传密码是通用的。

这决定了某基因导入任何种类的生物中，由其所编码的Pro中的氨基酸序列相同。如:

9

将人的胰岛素基因等导入细菌中，由细菌生产出人的胰岛素。将一些外源基因导入植物细胞,

培育出诸如抗虫棉花等植物新品种。将人的有关基因转移到动物细胞，得到诸如含有人干扰

素的羊奶等。

6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。

三、基因工程操作的基本技术路线

1、技术路线：

克隆载体--------1--------目的基因

V

重组DNA------T--------►受体细胞

克隆子

I

转基因生物

2、基因工程操作的基本步骤：

（1）提取目的基因：

目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽胞杆菌的抗虫基因，还有植物的

抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

从供体细胞的DNA中直接分离基因（如“鸟枪法”）、人工合成基因（反转录法、化学

合成法）。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。

三种目的基因提取方法的优缺点：

10

优点缺点

鸟枪法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一

个基因。

反转录法专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的

技术条件较高。

化学合成法专一性最强仅限于合成核甘酸对较少的简单基因

（2）目的基因与载体结合：

（3）将重组子导入受体细胞：目的基因导入受体细胞的方法如下：

「1、将细菌用CaC12处理，以增大细菌细胞壁的通透性。

J2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。

〔3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的

时间内就能获得大量的目的基因。

（4）目的基因的检测和表达：

检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。

表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。

3、图示基因工程操作的基本步骤：

大肠杆菌人类细胞

①分离DNA的

来源于两处：

包含目的基因

的人类DNA

包含目击基

因的人类DNA

⑤将质粒导入

到细菌细胞中

⑥筛选含有重犯质

粒的细菌细胞

11

细菌细胞

取出质粒取出DNA

、'—■博

用限制酶切断DNA

四、基因工程研究最突出的优点

打破了常规育种难以突破的物种之间的界线，可以使基因在不同生物之间进行转移和表

达。

第二节目的基因的获得

一、目的基因的含义、来源

1、目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期

表达产物的基因称为目的基因。

2、目的基因的来源：

,真核生物染色体基因组：蕴藏着大量的基因，是目的基因的主要来源。

原核生物染色体基因组'

J质粒基因组>所含基因数目较少，是目的基因的次要来源

病毒（噬菌体）基因组

线粒体、叶绿体基因组，

12

二、分离目的基因的途径

在分离目的基因时，可根据目的基因所在基因染色体基因组的大小、目的基因的大小、

序列是否已知等因素，采用不同的方法分离目的基因。目前.，主要采用以卜四种方法分离目

的基因：

(1)酶切直接分离法；

(2)PCR扩增法；

(3)化学合成法；

(4)构建基因组文库或cDNA文库分离法。

1、利用限制性内切核酸酶酶切法分离目的基因：

(1)内切脱氧核糖核酸酶的定义：

是一类能识别双链DNA中特殊核甘酸序列，并在合适的反应条件卜使每条链定位点

上的磷酸二酯键断开，产生具有5'-磷酸基(-P)和3'-羟基(-0H)的DNA片段的内切脱

氧核糖核酸酶。

(2)限制性核酸内切酶的分类：至今发现的限制性核酸内切酶有三类：I、II、川型的内

切酶。真正有用的是n型内切酶。

(3)限制性核酸内切酶的识别位点：限制性核酸内切酶在DNA上能够识别的核甘酸序列

称为识别序列或者识别位点。一般识别序列为4-6bp,大部分为二分体对称切割(双重交替

式)呈旋转对称或左右互补对称。即一条链的5、3,与另条链的3、5,的碱基相同。

例如：EcoRI的酶切位点是GAATTC(G与A之间切开)

Xho\的酶切位点是CTCGAG(C与T之间切开)

黏性末端：两条多核甘酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端

的•条链多出一至几个核甘酸，这样的末端称为黏性末端。3,端比5,短长的称为3,黏性末端;

反之，称为5,黏性末端。

平末端：如果两条多核甘酸链上磷酸二酯键断开后产生的DNA末端是平齐的，称为平末端。

(4)限制性核酸内切酶的反应体系：

'DNA片段：10微升

水：6微升

缓冲液:2微升

酶1：1微升

、前2：1微升

13

(5)限制性核酸内切酶的使用方法:

A.双酶切：常用方法

B.单酶切：很少使用

(6)图示酶切结果:

A.产生黏性末端:

B.产生平齐末端:

5，AAGATATCGTr

IIIIIIIIII

j.TTCTATAGCA$，

切割

夕AAG

AT3'5，ATCGT『

^——

n1

TTCII+IMII

夕丁A5，3/AGCA5,

平整末端

14

2、利用PCR的技术扩增目的基因：

PCR(polymerasechainreaction)技术即聚合酶链式反应技术，可以简单、快速、特异性

得在体外扩增某一DNA片段。

(1)PCR的发明:

1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR,Mullis由此获得1993年诺贝尔

化学奖。

TheNobelPrizeinChemistry

f1993

*forcontributionstothedevelopmentsofmethodswithinDNA-based

chemistry*

Pressrelease

"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method*

〜9*

KaryB.Mullis

•USA

LaJolla,CA,USA

1944-

Auiobiograuhy

“forhisfundamentalcontributionstotheestablishmentof

oligonucleiotide-based,site-directedmutagenesisandits

developmentforproteinstudies”

MichaelSmith

Canada

UniversityofBritishColumbia

Vancouver,Canada

1932-

Autobiography

(2)PCR的基本原理:

PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，以DNA互补链聚合反应为基础，

通过靶DNA变性，引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性杂交，耐热性DNA

聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。

15

(3)PCR的具体过程：

第一步：预变性。90-95℃(3-5分钟)，双链DNA变性成两条单链，作为PCR反应的

模板。

第二步：变性。90-95℃(30秒)，双链DNA变性成两条单链，作为PCR反应的模板。

第三步：退火.37-60℃(45秒)，引物优先与模板复性(引物的浓度高，引物的链短)。

第四步：延伸。70-75C下1-2分钟，耐热性DNA聚合酶在引物的3,端上加上核甘酸。

第五步：变性一复性一延伸重复20-35个循环。

第六步：后延伸。70-75C下10分钟。

第七步：反应终止。

(4)PCR反应体系：

■模板DNA：含目的基因的DNA片段。

■耐热性的DNA聚合酶：催化反应的进行，高温下仍保持活性，主要有TaqDNA聚合酶。

■PCR引物：与待扩增片段的两个末端互补，长度一般为20-22bp。

■dNTP：四种脱氧核糖核甘酸单体(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、)。

■水：灭菌水。

■反应缓冲液：维持反应的pH值。

(5)PCR反应的扩增效率：

在PCR反应过程中，由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板

DNA,所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加1倍。因此，PCR经过n次循环后，待扩

增的DNA片段理论上司.达到原拷贝数的2n倍。但是，由于每次循环的效率并非100%,实

际产量低于理论数值。

(6)PCR的发展：

PCR技术自问世以来，得到了极其广泛的应用与发展。目前，根据不同的目的已建立

了多种PCR技术，如：反向PCR、不对称PCR、锚定PCR、定量PCR等。

(7)图示PCR技术的反应过程：

16

3、化学合成目的基因：

目前，利用DNA合成仪，可根据待合成的DNA片段预定的核甘酸顺序，自动地将4

种核甘酸单体（A、T、C、G）按3,f5,方向连接成寡核甘酸片段。

DNA&ynthc«i^r

此种方法般用于合成较短的寡核甘酸片段（如：引物、寡核甘酸连杆、衔接头、较短

17

的目的基因等），很少用于合成较长的目的基因。如果要合成较长的目的基因，需先按照基

因的核甘酸顺序化学合成儿个200bp左右的DNA片段，然后采用酶促连接法等再组装成完

整的目的基因（即使这种方法能行得通，但实践中很少采用）。

4、通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因：

（1）基因组文库及cDNA文库的概念

基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在•个受体菌克隆子群体

之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗

传信息，称部分基因组文库。

cDNA（complementaryDNA）：以mRNA为模板逆转录出的DNA称为cDNA。

cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克

隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称cDNA文库。

（2）构建基因组文库的基本步骤

组织或细胞载体（选择一种）

mRNA

cDNA

I

大小分级

可供克隆的DNA片段------>连接片段和载体

将连接载体/靶DNA引入大肠杆菌（体外包装或转化）

鉴定文库

XX

筛选目的克隆扩增文库长期保存

18

（3）图示cDNA的克隆过程:

uanslbrrt»<ion.

lunpiifiaitixi

SynthessandOcmingofcDNA

19

(4)从基因组文库或c-DNA文库中获得目的基因

A.根据目的基因已知核甘酸序列进行筛选分离：

原理：根据目的基因已知的核甘酸序列制备核酸探针，对基因组或cDNA文库的­系列克

隆子的DNA分子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因。进一步对阳性克隆子的重组

DNA进行测序，与已知基因的核苜酸序列进行比较和鉴定，确定是否是待分离的目的基因。

B.根据目的基因特异性表达进行分离：

原理：不同组织器官中表达的基因类型不同。以不同组织器官中的总mRNA为探针，分别

对两种cDNA文库进行杂交比较，确定其中的阳性克隆子。如下图所示：

根cDNA文库叶cDNA文库根cDNA文库叶cDNA文库

20

第三节基因克隆载体

一、基因克隆载体(geneclonevector)的概念：

能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子称为基

因克隆载体。

二、基因克隆载体应具备的条件：

1、在合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点。

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2、能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA、

线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA的复制而同步复制。

3、必须含有供选择转化的标记基因。

4、克隆载体必须安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入除受体细胞以外的其他

生物的细胞。

以pBR322质粒载体为例，说明以上三个特点：

21

pBR»22

—ampR

，4.

£c<>R].、唆B一

Cj€>

|PE限制性内切除

外通D\八

（目的底因）

K）NA连接阶

**C,，F..

kJv»

宿jLDNAl导入大肠杆菌细胞

，CL'S距—

舍四杯水

质粒导入成功的菌落

的培养氐

元用粒细茵不能生K

单个荫落

1、只在四环素上生长而氨比

分离培养

西林上不能生长的菌落

是带有目的居因的菌落

2、在两种培养基上都能生

长的菌落是不带有目的一西底茶氯正的秫'

基因的菌落培乐医培养基

三、基因克隆载体发展阶段：

第一个阶段：质粒我体、入噬菌体我体、柯斯质粒载体为主。特点在宿主细胞内稳定遗

传、易分离、转化效率高，单克隆容量有限，一般小于45kb。

第二个阶段：主要是酵母人工染色体、细菌人工染色体、源于噬菌体P1的人工染色体、

人类/哺乳动物人工染色体。特点：载体的容载能力扩大，达lOOkb至几个Mb。

第三个阶段：双元细菌人工染色体和可转化人工染色体。特点：载体的容载能力大，具

备转化植物的功能。

四、几种不同类型的载体以及载体的特点：

22

1、大肠杆菌质粒载体

A.大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，能够在转化的大肠杆菌中按质粒复

制的形式进行复制。如：pBR322、pUC18/19«

特性：a.pBR322大小为4.363kb为松弛型质粒，复制起始点来源于pMBl。

b.四环素抗性基因（Tetr）来源于pSClOl。

氨芳青霉素抗性基因（Ampr）来源于pSF2124。

c.8种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于Tet抗性基因和Amp抗性基因中。

优点：

a.分子量小4363bp,统一规定记数从EcoRI识别位点GAATTC的第一个T为1。

b.两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。Tetr基因内

有5个酶切位点，Ampr基因内有3个酶切位点，Ori内有2个能切位点。

c.具有较高的拷贝数1000-3000/细胞。

d.插入失活：因插入外源DNA片段而使基因失活的现象。

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B.大肠杆菌质粒载体pUC18/19的序列结构如下所示：

pUC系列质粒载体具有三个显著特点：

(1)分子量更小，仅为2.7KB,容纳外源DNA量增大：具有更高的拷贝数(不用氯霉素扩

增，每个细胞含500-700个拷贝)。

(2)含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ。，可利用a-互补原理进行蓝白筛

选。

(3)多克隆位点区(MCS)：由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶

会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端,

进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。

其MCS区与Ml3mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到Ml3mp

载体，进行DNA测序和体外突变等研究。

pUC18

lindlllSphIPstISallXbalBamHISmalKpnlSacIEcol

2、农杆菌Ti质粒载体

(1)根癌农杆菌：根癌农杆菌可在许多双子叶植物中导致冠瘦病的形成。冠瘦瘤的形成是

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由于Ti（tumorinducing）质粒导致的。侵染后，一部分分子将整合到植物的染色体DNA中，

这•片段称为T・DNA,大约有15kb.30kb（编码产物可使植物产生冠瘦瘤）。T-DNA只要保

留两端的边界序列，即使中间的序列被任何外源的基因所替代，仍可整合到植物基因组中。

（2）作用：利用Ti质粒将新的基因引入植物。可以将基因插入T-DNA中，细菌就可以将它

整合到植物的染色体DNA中。

（3）图示利用Ti质粒载体将外源基因引入植物细胞中的过程：

A^robncteriimihnner/iiciens

DNAcontainingthe

giwinte