基因工程和生物技术的安全与伦理【精讲精研+能力提升】 高考生物一轮复习（新教材新高考）

浙科版2019版总复习选择性必修三第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第一节体液调节是通过化学信号实现的调节第二节神经系统通过下丘脑控制内分泌系统第二节神经系统通过下丘脑控制内分泌系统第33课时基因工程与生物技术安全与伦理第十单元生物技术工程

考点一DNA重组技术的基本工具1.基因工程(1)基因工程(重组DNA技术)定义：有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。(2)操作水平：分子水平。(3)变异原理：基因重组(4)基因工程诞生的理论基础包括：DNA是遗传物质的证明、DNA双螺旋结构的发现和“中心法则”的确立、遗传信息的传递和表达的机制认定、遗传密码的破译。(5)基因工程诞生的技术保障：限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒载体的发现与应用。其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要的手段，而载体能够将外源基因运送到细胞中。(6)异种生物的DNA拼接成功的原因：一种生物基因在另一种生物细胞内能够表达成功的原因：所有生物的DNA具有相同的化学组成（脱氧核苷酸）和空间结构（双螺旋结构）。各种生物共用一套遗传密码。(7)基因工程核心技术：构建重组DNA分子。（8）基因工程育种的优点与杂交育种相比：克服远缘杂交不亲和障碍（突破物种间的界限）与诱变育种相比：能定向地改造生物的遗传性状2．重组DNA技术的基本工具限制性内切核酸酶(1)主要来源：细菌等微生物。（酵母菌中也有发现）(2)存在于细菌等微生物中的作用：破坏外源DNA，自身DNA不会被破坏（自身DNA经过相应的化学修饰），起到保护作用，是其进化出的一种防御机制。（将外源DNA分子从内部剪切成片段，不是核苷酸）(3)作用特点：识别双链DNA上特定的一小段核苷酸序列，并催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解，使得DNA双链在特定的位置断开。思考一：能否切割烟草花叶病毒上人们想要的目的基因？识别的序列一般4~8个核苷酸对，6个核苷酸对最常见。例1.（2022·强基联盟5月联考）4种不同限制性内切核酸酶的识别序列和切割位点如下图所示。下列相关叙述正确的是（

）A．限制性内切核酸酶在基因工程中的作用是用于获取目的基因或构建基因文库B．限制性内切核酸酶作用的原理是它们能识别特定的碱基序列并破坏碱基对之间的氢键C．用EcoRI完全酶切某生物基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度约为4000个碱基对D．为减少构建表达载体时目的基因与载体的错误连接，选用BamHI和BglII切割目的基因两侧C、EcoRⅠ识别的特定核苷酸序列为6个碱基对，因此出现该特定序列的概率为（1/4）6即1/4096，所以理论上完全酶切后得到的DNA片段平均长度约为4000个碱基对，C正确；C

③结果：产生黏性末端或平末端。黏性末端：

被限制酶切开后的DNA的两条单链的切口处，各带有几个伸出的无互补配对的核苷酸序列，这个序列叫黏性末端。（末端有凸出的单链部分）思考一：用限制酶切割后的DNA分子，有几个黏性末端？这几个黏性末端有何特点？两个，黏性末端相同且它们之间正好能够互补配对。5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ思考二：用不同种限制酶切割不同的DNA分子，黏性末端可能互补配对吗？有可能用限制性内切核酸酶剪切不同的DNA分子得到了不同来源的片段，具有互补配对的黏性末端或平末端。这正是能将不同来源的DNA片段连接起来的基础。思考三：限制性内切核酸酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—限制性内切核酸酶II的识别序列和切点是↓GATC—下图表示含有某目的基因的DNA分子片段。（1）要想获得某个特定的基因，至少需要几个限制性酶切位点，切断几个磷酸二酯键？产生几个黏性末端？（2）若想将目的基因剪切下来，应选择何种限制性内切核酸酶？至少需要2个限制酶的切点,切断4个磷酸二酯键,产生4个黏性末端酶II(2)DNA连接酶①作用：将DNA片段连接成一个重组DNA分子。②类型③DNA连接酶和限制酶的关系

C

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AA

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AA

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G重组DNA分子思考1：用同一种限制酶切割DNA后再连接起来，还能被原来的限制酶切割吗？可以

C

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TTGGTT

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C重组DNA分子思考2：用两种不同的限制酶切割DNA后再链接起来，还能被原来的限制酶切割吗？不一定核心归纳1：与DNA相关的几种酶的比较

项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用对象DNA片段DNA分子单个的脱氧核苷酸DNA分子作用结果将DNA片段连接成一个重组DNA分子切割DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链(3)载体①条件如抗生素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。最好每种限制酶的识别序列只有一个，且位于启动子和终止子之间（如果切割农杆菌，则要位于T-DNA上）。②种类：质粒、噬菌体、动植物病毒。（天然质粒经人工改造）③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞，使目的基因在受体细胞内能进行大量复制和表达④特点：可在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。⑤质粒：独立于细菌拟核DNA之外的较小的环状DNA分子，是一种常用载体。3．活动：DNA的粗提取和鉴定(1)活动原理①幼嫩的植物材料如果经过冷冻后再研磨，细胞结构容易被破坏。②用十二烷基硫酸钠(SDS)处理材料，能使核蛋白变性并与DNA分离。③乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解。④DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成钠盐。⑤DNA钠盐不溶于酒精溶液而某些蛋白质能溶于酒精。⑥在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。(2)活动步骤1．DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同核心归纳2：DNA粗提取与鉴定实验2.实验中的注意事项(1)实验材料的选取：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织成功的可能性更大。(2)破碎细胞，获取含DNA的滤液①实验材料是植物细胞，加入一定的研磨液，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集滤液。②实验材料是动物细胞，如鸡血细胞，在含鸡血细胞的液体中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。(3)提取和分离DNA用塑料离心管的原因：细胞破碎后释放出的DNA容易被玻璃容器吸附；由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附一部分，提取到的DNA就会更少。1.限制性核酸内切酶的选择方法(1)根据目的基因两端的限制性核酸内切酶切点确定限制性核酸内切酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制性核酸内切酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制性核酸内切酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制性核酸内切酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。新高考新思考：(2)根据质粒的特点确定限制性核酸内切酶的种类①所选限制性核酸内切酶要与切割目的基因的限制性核酸内切酶相一致，以确保具有相同的粘性末端(或平末端)。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制性核酸内切酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制性核酸内切酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不只一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。例2.（2021·温州中学模拟）图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠB．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ

酶切位点有1个C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理D．一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团【答案】B例3.（2022·宁波效实中学期中）图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性内切核酸酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。下列说法正确的是（

）A．图1的一条脱氧核苷酸链中相邻碱基通过氢键相连B．限制性内切核酸酶SmaⅠ切割图1中DNA片段后，产生的黏性末端长度分别537bp、790bp、661bpC．若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d；用限制性内切核酸酶SmaI完全切割D和d，产物中共有4种不同DNA片段D．若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制性内切核酸酶处理后进行连接，形成重组质粒，可选择BamHⅠ或MboⅠC2．载体上标记基因的作用载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，作用机理如图所示：例4．某一质粒载体如图所示，外源DNA插入ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____________________________________________________(答出两点)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是____________________________________________________________；并且_________________和______________________________________(或含有重组质粒)_____________的细胞也是不能区分的，其原因是___________________________________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有___________的固体培养基。能自我复制、具有标记基因、具有一至多个酶切位点(任答两点)两者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不能生长含有质粒载体含有插入了目的基因的重组质粒两者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图中的1、2、3、4、5菌落;再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4;则在含四环素培养基上不生长的即为含重组质粒的菌落,如图中的1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考点二基因工程的基本操作程序与DNA片段的扩增

及电泳鉴定1.基因工程的基本操作程序获取目的基因、构建重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、检测目的基因及其表达产物。原核生物基因编码蛋白质的核苷酸序列是连续的。

科学工作者分离得到了某原核生物基因，并将其解离成两条单链。现让其中一条链与由该基因转录而来的信使RNA杂交配对，结果如图所示。非编码区非编码区编码区信使RNA基因的一条链ＡＢＣ2.原核细胞基因与真核细胞基因结构的异同非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工mRNA前体成熟mRNA不能编码蛋白质的序列=内含子+非编码区序列编码序列=外显子12345启动子终止子转录真核生物基因2．原核细胞基因与真核细胞基因结构的异同

获取目的基因的方法（2）目的基因的序列已知：从基因文库获得（1）目的基因的序列未知：目的基因：人们所需要的基因。如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等获取方法：根据蛋白质中氨基酸序列根据mRNA中的碱基序列（逆转录法）化学合成方法已经给了目的基因：聚合酶链式反应（PCR技术）扩增用适当限制酶切割与载体连接导入受体菌群提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）①基因组文库：把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。基因组中所有DNA序列克隆的总汇被称为基因组文库。(1)借助载体建立基因文库核酸酶H与载体连接导入受体菌群DNA聚合酶mRNA逆转录酶杂交双链单链DNA双链DNA该生物cDNA文库②构建cDNA文库：从特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA，然后在逆转录酶等酶的催化下，以mRNA为模板合成互补的DNA，即cDNA。最后，借助载体，利用与构建基因组文库相同的方法构建cDNA文库.由于基因的选择性表达，不同组织细胞的cDNA文库是不同的，同一组织细胞在不同的发育阶段，cDNA文库也会有差异。例如，胰岛素基因的cDNA只能在由胰岛β细胞建立的cDNA文库中找到。比较两者异同该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因(含有不表达的内含子，这样获得的基因在原核生物体内不能表达)转移到原核生物中去。所以此方法不适合获得真核生物目的基因的编码序列。文库类型cDNA文库基因组文库构建基因文库的过程某种生物发育的某个时期的mRNA↓反转录cDNA与载体↓连接导入

受体菌群体某种生物体内全部DNA限制酶↓许多DNA片段

分别与↓连接导入载体受体菌群体

文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间基因交流可以部分基因可以说明

基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性cDNA文库与基因组文库的比较目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列化学合成目的基因逆转录法根据已知氨基酸序列直接合成DNA(2)化学合成法(已知序列)：将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来。此方法成本较高，适于合成序列较短的基因。(3)聚合酶链式反应技术(PCR技术)①特点：简便、快速、灵敏。②原理：DNA双链复制③应用：医学诊断、法医鉴定、古生物学研究等方面。④条件：模板：待扩增的DNA分子。原料：4种脱氧核苷三磷酸，即dNTP，N代表A、T、G、C四种碱基。酶：耐高温TaqDNA聚合酶。引物：根据目的基因的部分核苷酸序列人工合成的两段很短的单链DNA，分别可以与两条DNA模板链复制起始端互补配对成小段双链。2个引物分别结合在模板链的3′端。⑤过程：包括多次循环，每个循环分为3个步骤。TaqDNA聚合酶哪些因素会影响变性温度、变性时间？温度过高或时间过长会造成什么影响？模板DNA碱基组成（CG含量），DNA长度，降低TaqDNA聚合酶活性。引物碱基组成（CG含量），引物长度（引物越短，GC含量越低，需要退火温度越低。）过高：引物与模板难以结合，甚至无扩增产物过低：引物与模板易发生非特异性结合（错配）退火温度的设定与引物的哪些方面有关？退火温度过高或过低会造成什么影响？延伸的温度、时间与什么有关？酶的种类和片段长度过高：产物易变性，不稳定过低：易错配，产物特异性降低，温度对酶的活性影响很大。利用PCR技术扩增目的基因延伸变性退火因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物(提供3'端)。所以PCR只能从5'端到3'端。为什么需要引物？扩增特点：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）扩增DNA片段的起点和终点由2个引物决定产物鉴定(3种)利用电泳技术鉴定经过PCR扩增每轮DNA分子各有多少个，所占比例为多少？PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段DNA类型数量第1轮第2轮第3轮第4轮第n轮含母链最大①中间型②目的基因③全部子代消耗引物的数量1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出2n个DNA片段，共需要引物数量为2n＋1－2个。2222200220442816682n-22n-2n2n思考

1.图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程(1)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和

扩增出该目的基因的关键是______________________________________。酸序列设计引物根据目的基因两端的核苷(2)如果循环n次，则共需消耗______对引物。要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的5′端分别添加上______________________。2n－1限制酶的识别序列（2023·届高三Z20第一次联考）抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）在人体中主要由肝脏合成，是存在于血浆中的一种重要的抗凝血因子。研究者将人的抗凝血酶Ⅲ基因导入奶山羊细胞，获得乳汁中含有大量重组人的抗凝血酶Ⅲ的转基因克隆奶山羊。已知β-酪蛋白广泛存在于哺乳动物的乳汁中。回答下列问题：(1)抗凝血酶Ⅲ基因的获得与表达载体的构建：从人的_____中获得抗凝血酶Ⅲ基因的mRNA，逆转录成cDNA，并利用_____技术进行扩增。为顺利将抗凝血酶Ⅲ基因连接到奶山羊β-酪蛋白基因表达载体上，在设计引物时，应在引物前加入_____.肝脏PCR限制酶的识别序列(3)图2两组引物(只标注了部分碱基序列)____(是、否)合

理，理由是_________________________________________________________________________________________________________。否部碱基互补配对而失效第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局(4)PCR过程中，如果两种引物之间互补序列较长的话，

可能造成__________________________________________________________________________。从而使引物不能很好地与模板DNA链结合可能造成复性过程中，引物之间相互结合，4．利用表达载体构建重组DNA分子(1)克隆载体：用于大量扩增外源DNA的载体。(2)表达载体：使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转录和翻译信号。质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同种一个切口两个黏性末端思考：得到的一定是重组DNA分子吗？(3)用同种限制性内切核酸酶剪切含有目的基因的DNA片段以及表达载体，然后用DNA连接酶将它们连接起来，可完成体外重组，形成重组的DNA分子。(4)基因表达载体的组成复制起点：能复制并带着插入的目的基因一起复制甲0.8和3.31.0和3.1思考：5．将重组DNA分子导入受体细胞(1)受体细胞：接受目的基因的细胞。(2)根据受体细胞类型可选择不同的基因导入方法低温、用Ca2+（低浓度CaCl2溶液）处理细胞,造成细胞膨胀，细胞膜的通透性（增强细菌捕获外源DNA的能力）改变。（低温）下使外源DNA黏附于受体细胞表面，最后进行短暂的热刺激处理，使外源DNA转入细胞。植物组织培养技术农杆菌感染植物细胞重组Ti质粒转化农杆菌Ti质粒上的T-DNA片段能整合到植物染色体DNA中农杆菌转化法（常使用）(1)两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指携带目的基因的T-DNA整合到受体细胞染色体的DNA上。(2)两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入植物受体细胞。6.检测目的基因及其表达产物(1)借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传。（实例：利用含有青霉素和X-gal的培养基鉴定大肠杆菌克隆。）例如，某些应用于大肠杆菌的质粒具有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因两种标记基因。可使大肠杆菌具有青霉素抗性并能够合成β-半乳糖苷酶，该酶能催化无色的X-gal（5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷)分解为半乳糖和蓝色的5-溴-4-氯淀，使菌落呈现蓝色，将目的基因插入这种质粒上的LacZ基因中，使该基因失活，再将重组质粒导入大肠杆菌中，从而使含有重组DNA的大肠杆菌在含有X-gal和青霉素的培养基上形成白色菌落；而只导入不含目的基因的载体的大肠杆菌则形成蓝色菌落，不含有载体的大肠杆菌无法生长。含重组DNA的大肠杆菌：白色不含目的基因的载体的大肠杆菌：蓝色不含有载体的大肠杆菌：不能生存(2)利用PCR技术检测（更精确）①根据目的基因的序列设计PCR引物，利用待检DNA为模板进行PCR。②通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物。(3)利用核酸分子杂交技术检测（精确）

①用化学方法使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上。②加入探针（放射性或荧光标记的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA），在适当的条件下探针与互补的目的基因片段形成双链。③漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针后，若硝酸纤维素膜仍具有放射性或荧光，则可判断待检DNA中含有目的基因。④运用核酸分子杂交技术还可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。阅读材料是否转录：运用核酸分子杂交技术还可检测受体细胞中是否含有目的基因转录出的mRNA。（4）是否翻译成功（表达成功）：抗原­抗体杂交技术：以目的基因表达出的蛋白质为抗原，制备能与其特异性结合的并能被放射性或荧光标记的抗体。(5)观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传，是判断转基因成功的直接证据。需要进行抗虫、抗病接种实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。7．活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定(1)活动原理：聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特定基因或DNA片段的技术，经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段。本活动使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，再通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。使用亚甲基蓝对凝胶进行染色，再用75%酒精以及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电荷的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响，还与凝胶的浓度、DNA分子的构象等有关。。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。利用电泳技术鉴定PCR扩增产物DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。

含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNAMarker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNAMarker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。利用电泳技术鉴定PCR扩增产物（2）.材料用具PCR仪，微量移液器及枪头，微量离心管（不能用玻璃的），培养皿，三角瓶，封口膜，橡皮筋，冰盒，记号笔，三脚架，玻璃板，微波炉或水浴锅，离心机等；琼脂糖凝胶电泳设备，包括梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪。（注意：枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌。）

材料：食用高活性干酵母，即酿酒酵母。酵母细胞悬液：称取0.1g干酵母粉，置于盛有100mL无菌蒸馏水的三角瓶中，盖上封口膜并用皮筋绑好，摇匀后在温暖的环境下活化2h。

PCR相关试剂：以下溶液在-20℃条件下冷冻保存，使用前置于冰盒内或冰块上。(1)市售10×扩增缓冲液（含Mg2+)（增强Taq酶活性）。(2)市售10mmol/L4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。(3)市售2U/uLTaqDNA聚合酶(U为酶活力单位，定义为30℃、最适pH、底物浓度饱和的条件下，1min转化1umol底物所需要的酶量)。(4)无菌水：将双蒸水在高压灭菌锅中灭菌，制成无菌水。（除去初次蒸馏剩下的氨气、二氧化碳、有机物）(5)10μmol/L引物A溶液：序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'。用无菌水将市售引物稀释成10μmol/L溶液。(6)10μmol/L引物B溶液：序列为5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。用无菌水将市售引物稀释成10μmol/L溶液。电泳相关试剂：Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液（维持PH，导电）：将市售50×电泳缓冲液稀释50倍。或配制5×TBE电泳缓冲液：称取54gTris，27.5g硼酸溶于800mL蒸馏水中，加入20mL的0.5mol/LEDTA（螯合Mg2+防止电泳时激活DNA酶及防止Mg2+与核酸形成沉淀），调节pH到8.0，加水定容至1L，室温保存备用，使用时稀释5倍。(2)市售6×（适当改良6倍浓缩）上样缓冲液(loadingbuffer)；内含甘油（防止样品漂浮出点样孔）可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。(3)市售DNA相对分子质量标准物(Marker)染色相关试剂：(1)0.1%亚甲基蓝溶液：称取0.1g亚甲基蓝溶于100mL蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛，避光保存。

(2)75%酒精。

(3)保存于4℃条件下的蒸馏水。或使用0.002%亚甲基蓝溶液：将2mL的0.1%亚甲基蓝溶液加入10mL电泳缓冲液中，再加88mL蒸馏水，避光保存。用具①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）(2)方法步骤：①PCR扩增：加液：使用微量移液器将PCR体系各成分加入0.2mL已灭菌的微量离心管中，注意酵母细胞悬液需摇匀后再吸取，用微量移液器反复吹吸使反应液混合均匀。离心：以3000r/min的转速离心30s，使反应液集中于微量离心管的底部。（提高反应速率）反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置反应条件。注意：使用微量移液器前，必须先装好相应的已灭菌一次性吸液枪头，避免液体进入微量移液器内部。推动按钮共有2挡停顿，一直按到底是第2挡。吸取液体时，先转动调节轮至目标体积（不要超出微量移液器量程），按压推动按钮至第1挡并缓慢抬起吸取相应体积的液体。放出液体时，再次按压推动按钮至第2挡，液体全部流出后抬起按钮，推动卸枪头按钮卸掉用过的枪头。枪头在每吸取一种溶液后更换一次，避免用手接触枪头。

②琼脂糖凝胶电泳

溶化：称取琼脂糖0.25g，加到盛有25ml电泳缓冲液的三角瓶中。将三角瓶盖上封口膜并用橡皮筋绑住后，用微波炉或沸水浴加热，使琼脂糖溶化呈透明状。倒模：将琼溶化的脂糖倒入胶盒，若琼脂糖中有气泡，可用枪头除去气泡。凝固：待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，凝胶上梳齿的位置成为加样孔。加液：将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。第一个加样孔：加

DNAMarker20uL和4uL上样缓冲液混合液），第二个加样孔：加20uLPCR产物和上样缓冲液，第三个加样孔：加10uL20uLPCR产物和上样缓冲液作对照。(3)染色

方案一

方案二倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm，染色8min。凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。75%乙醇脱色1min,不断晃动培养皿。

染色*替换染色方法：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002%亚甲基蓝溶液，并没过凝胶。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。冷蒸馏水脱色。可更换被染蓝的蒸馏水。(4)观察①在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置，注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照。②用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离，即每个DNA条带中央到加样孔的距离，记录于表中。根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。（5）、注意1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套5.PCR扩增不能随意加大试剂用量6.若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的负极7、结果分析与评价1.成功扩增出DNA片段的判断依据是什么？2.进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？3.如图所示，该片段大小约为____bp

可以在紫外灯下直接观察到DNA条带（根据条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果）应该为一条条带7504.如果未出现条带，可能原因是什么？5.如果出现不止一条条带，可能原因是什么？漏加了PCR反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；②复性温度过低；③DNA聚合酶质量不好等；1.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？为什么？能。可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。新高考新思考2.基因工程操作的四个易错点(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的T-­DNA转移并整合到受体细胞的染色体DNA上。(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子。启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止，目的基因插入二者之间；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。3.PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定（1）加入的DNAMarker未跑出条带可能原因有哪些？（2）出现非特异性扩增条带可能的原因有哪些？（3）若在新冠核酸检测中选用电泳进行产物鉴定，除DNAMarker外还可以设置哪些对照组？新冠cDNA阳性对照，非目的基因的DNA作模板扩增的阴性对照，无菌水的空白对照。退火温度低，引物结合到其他部位，引物设计特异性不强。DNAMarker没有沉在加样孔，或者留在加样孔附件或者迁移到凝胶外，或DNAMarker里没有DNA样品。（4）实时荧光定量检测资料：TaqMan探针是实时荧光定量RT—PCR技术中一种常用探针，当探针完整时，荧光基团(R)发出的荧光信号被淬灭基团(Q)吸收而不发荧光；当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到。思考：(1)

.Taq酶的功能.Taq酶的功能除了催化DNA子链的延伸,还能催化RNA(TaqMan探针)的水解.(2)若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a，则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与有关。在检测过程中,随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，加了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。可通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。“平台期”出现的最可能的原因是试剂盒中等有限，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。(3)虽然荧光RT-PCR是当前被广泛认可的检测手段之一，但是不断有“假阴性”现象报道，通过上述过程分析,“假阴性”的可能原因有(填字母)。a.通过咽拭子取样不规范或取样所获样本量不足b.在样本运输、检测中出现了损坏和污染c.病毒的相关序列发生了基因突变。病毒样品模板RNA含量、扩增次数原料、引物和探针数量（Taq酶活性）abc4．如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图所示(以EcoRⅠ酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一___________________________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′­羟基与5′­磷酸间形成______________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得_____________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________________________________。限制性内切核酸(或限制)核苷酸序列磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板合成的DNA链的延伸(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是_________(从引物①②③④中选

择，填编号)。②④(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。A．5′—AACTATGCG……AGCCCTT—3′B．5′—AATTCCATG……CTGAATT—3′C．5′—GCAATGCGT……TCGGGAA—3′D．5′—TTGATACGC……CGAGTAC—3′B

考点三基因工程的应用与蛋白质工程1.基因工程改善了人类的生活品质(1)运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断。①核酸分子杂交和PCR技术常用来检测患者自身携带的缺陷基因。例如，检测引起镰刀形贫血症的基因突变。引起镰刀形贫血症的基因突变，使血红蛋白基因缺少一个限制性内切核酸酶MstⅡ的识别序列，因为该识别序列5'-CCTGAGG-3'中的A突变成T。检测时，先用PCR技术扩增待检者基因的相应片段，然后用MstⅡ剪切扩增后的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的DNA片段，并结合DNA分子杂交技术，则可判断待检者的基因组成，如图4-34所示。例如，设计特异扩增HIV病毒部分基因片段的PCR引物，使用PCR技术检测患者少量血液或细胞中的DNA，根据凝胶电泳结果就可以判断患者是否携带HIV病毒。甚至在感染的早期，就能从血液中直接检测到微量的病毒基因，如图4-35所示。②灵敏度极高的PCR技术常用于诊断患者是否感染某种病原体。例如，根据凝胶电泳结果就可以判断患者是否携带HIV病毒。目前，人们运用PCR并结合其他技术，不仅可以在患者未发病，甚至出生前就能确诊其是否患有镰刀形贫血症、血友病等疾病，还可以根据某些核苷酸序列的特异性差异来推测某人患阿尔茨海默病以及癌症等疾病的风险。随着基因测序技术进一步发展，有望研制出专门针对个人基因特点的药物。

考点三基因工程的应用与蛋白质工程1.基因工程改善了人类的生活品质(1)运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断。(2)向患者体内导入正常基因进行基因治疗。①基因治疗：向有基因缺陷的细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷（并非修复），从而达到治疗的目的。②基因治疗主要针对一些严重威胁人类健康的遗传病，如血友病、恶性肿瘤等。③基因导入细胞的过程常以修饰过的病毒为载体，如腺病毒和逆转录病毒。1990年美国完成了世界首例重症免疫缺陷病的基因治疗。

考点三基因工程的应用与蛋白质工程1.基因工程改善了人类的生活品质(1)运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断。(2)向患者体内导入正常基因进行基因治疗。(3)利用转基因生物生产基因工程药物。比较项目乳腺生物反应器工程菌含义指外源基因在哺乳动物的乳腺中特异性表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类基因结构动物基因的结构与人类基因的结构基本相同细菌基因的结构与人类基因的结构有较大差异基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性受体细胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基因的方式显微注射法感受态细胞法生产条件不需要严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需要的温度、pH、营养物质、浓度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞或培养液中提取乳腺生物反应器与工程菌比较受性别、年龄的限制将药用蛋白基因和在乳腺中特异性表达的蛋白质编码基因的启动子等调控元件重组在一起,构建出重组DNA分子。

考点三基因工程的应用与蛋白质工程1.基因工程改善了人类的生活品质(1)运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断。(2)向患者体内导入正常基因进行基因治疗。(3)利用转基因生物生产基因工程药物。(4)转基因动物可为研究疾病机理提供模型。可以获得基因、改造基因，还可以“敲除”某些基因。①通过在基因中插入DNA片段使该基因永久失活，再通过观察转基因生物性状变化，可以推测该基因的功能。②实例：科学家发现敲除肠碱性磷酸酶基因的小鼠更容易发胖，从而推测该基因有“保持身材”的作用，也许不久的将来肥胖会被“根治”。

考点三基因工程的应用与蛋白质工程1.基因工程改善了人类的生活品质(1)运用核酸分子杂交、PCR等技术进行基因诊断。(2)向患者体内导入正常基因进行基因治疗。(3)利用转基因生物生产基因工程药物。(4)转基因动物可为研究疾病机理提供模型。可以获得基因、改造基因，还可以“敲除”某些基因。(5)应用基因工程技术进行法医鉴定，能保护受害者权益。(6)基因工程可培育具有优良性状的农牧业品种。(7)基因工程技术可用于保护生态环境。2．蛋白质工程是基因工程的延伸(1)基因工程的局限：目的基因的表达结果有时并不理想，合成的蛋白质不能很好地行使功能。(2)蛋白质工程遵循“中心法则”。(3)蛋白质工程的思路：通过设计和改造编码蛋白质的基因，从而改变氨基酸序列，最终获得特定功能的蛋白质。(4)蛋白质工程的步骤：①建立蛋白质功能与结构的联系。②依据所需蛋白质的功能，设计改造天然蛋白质的空间结构，推测出其氨基酸的序列。③根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列。④利用基因工程技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列⑤将改造了的基因导入受体细胞后进行表达。

蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质基本思路由于基因决定蛋白质,因此要对蛋白质的结构进行设计改造,最终还必须通过改造或合成基因来完成“二看法”判断基因工程和蛋白质工程区别基因工程与蛋白质工程的比较联系(1)蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。(2)基因工程中所利用的某些酶可通过蛋白质工程进行修饰、改造。

3．以测序为基础建立的基因数据库是人类共有的财富(1)2003年人类基因组计划测序完成，我国也参与其中并做出很大的贡献。(2)基因测序技术不断发展，不仅速度越来越快，而且成本也越来越低。(3)多个国家和机构建立了庞大的生物信息数据库。①数据库信息不仅通过互联网共享，还定期交换数据进行更新②现在通过访问互联网，任何人都可以方便地检索出需要的信息。③科学家也能通过比对核酸或蛋白质的序列重新审视生命进化的历程，深度解码个人的遗传信息。

新高考新思考1．乳腺生物反应器经过有性生殖产生的后代一定可以产生目标蛋白质吗？为什么？不一定。①目的基因在受体细胞中不是成对存在的，相当于杂合子，配子中可能不含该基因，则有性生殖产生的后代中可能不含目的基因。②有性生殖产生的后代可能为雄性，不能分泌乳汁。2．为什么蛋白质工程改造基因而不是直接改造蛋白质？①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大。②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质。③基因可以遗传，蛋白质无法遗传。

考点四生物技术的安全与伦理1.转基因产品已经进入人们的日常生活(1)转基因生物：含有重组DNA的生物。(2)转基因食品：转基因生物本身或其加工产品，它可来自转基因的植物、动物、微生物等。现阶段的转基因食品主要来自转基因作物。2．理性看待转基因技术的应用(1)关于转基因食品的安全性①担心转入的外源基因或基因产物是否对人畜有毒。②担心转入了控制过敏源基因的植物产品是否会对过敏人群造成不利影响。(2)转基因作物的环境安全性①由于导入新的外源基因，转基因作物获得或增强了生存竞争和繁殖能力，使其在很多方面都强于亲本或野生种。若被推广种植，可能会影响生态平衡。②在自然条件下，栽培作物种内、栽培作物与其近缘野生种间、栽培作物和杂草之间都有可能发生基因漂移。基因漂移指转入的基因可能会从转基因植物的体内扩散到环境中。

可以借助一定的手段使花粉失去活性,从而防止发生基因漂移,如我国科学家将来自玉米的α-淀粉酶基因与目的基因一起转入植物中,由于α-淀粉酶基因可以阻断淀粉储藏使花粉失去活性,因而可以防止转基因花粉的传播。或将目的基因转入到叶绿体DNA中。（因为叶绿体与线粒体在细胞质里繁殖时只在卵子里有精子里没有而植物传粉只传精子卵子不离开本株进而你的修改基因不会被扩散出去，所以可以防止基因污染。）如何防止发生基因漂移?转基因作物中的一些抗除草剂、抗杀虫剂和抗病毒的抗性基因就有可能通过花粉杂交等途径向其同种或近缘野生种转移，使其获得转基因生物体的抗性特征，成为对其他作物构成严重威胁的“超级杂草”。转基因抗虫作物长期、大规模种植，再加上“超级杂草”的产生，会对目标害虫和非目标害虫起到选择的作用，从而可能导致侵染力和致病性更强的“超级害虫”出现，对生态环境造成更大的危害。有研究表明，转Bt基因抗虫棉对第―第二代棉铃虫有很好的抵抗作用，但第三代、第四代棉铃虫已对该转基因棉产生了抗性。转基因生物的优缺点(1)优点:①提高粮食产量;②减少农药使用,从而减轻环