基因工程原理 柯斯质粒等其他高级载体

第五章柯斯质粒等其他高级载体用于克隆大片段DNA的载体特殊用途的载体1本文档共41页；当前第1页；编辑于星期二\12点24分用于连入更长DNA片段的载体基因组绘图与测序需要把更长(>18kb)的片段连入载体柯斯质粒(cosmid)Fosmids噬菌体P1载体系统(bacteriophageP1vector)BAC(bacterialartificialchromosome)PAC(P1-derivedartificialchromosome)YAC(Yeastartificialchromosome)Mega-YAC2本文档共41页；当前第2页；编辑于星期二\12点24分3本文档共41页；当前第3页；编辑于星期二\12点24分柯斯质粒载体“柯斯克隆”（cosmidcloning）的理论依据：在λphage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点)λphage的多连体分子是由cos连接而成的。末端酶(terminase)或叫Ter体系——即λphage具有一种位点特异的切割体系(site-specificcuttingsystem).coscoscoscoscoscos4本文档共41页；当前第4页；编辑于星期二\12点24分柯斯质粒载体中克隆的简化示意图5本文档共41页；当前第5页；编辑于星期二\12点24分6本文档共41页；当前第6页；编辑于星期二\12点24分7本文档共41页；当前第7页；编辑于星期二\12点24分柯斯载体的特点第一，具有λ噬菌体的特性。第二，具有质粒载体的持性。第三，具有高容量的克隆能力。第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。8本文档共41页；当前第8页；编辑于星期二\12点24分柯斯克隆技术的优点由于柯斯载体兼具了质粒和λ噬菌体两方面的特性，提高了克隆外源DNA片段的能力，可达45kb左右，因此对于构建真核生物基因文库是一种特别有用的克隆载体；应用柯斯质粒作克隆载体，所形成的非重组体的克隆本底比较低，从而提高了筛选具外源DNA的重组体质粒的几率。9本文档共41页；当前第9页；编辑于星期二\12点24分柯斯克隆技术的缺点由于经核酸内切酶切割作用产生的线性的柯斯质粒载体，彼此间会通过分子内重组形成多聚体分子。由于经核酸内切酶做局部消化的折合基因组产生出来的DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片段随机连接在一起的情况。10本文档共41页；当前第10页；编辑于星期二\12点24分

缺点克服办法

a.碱性磷酸酶的脱磷酸作用为克服上述的局限性，一般是在连接反应之前，先用碱性磷酸酶对线性的柯斯质粒DNA，使之脱磷酸，以阻止它们之间发生自连。b.电泳分部分离克服上述局限性的另一种较为有效的办法是，在连接反应前，先将局部消化的DNA进行电泳分部分离，富集大分子量的片段(31-45Kb)，再同线性化的柯斯载体DNA连接。11本文档共41页；当前第11页；编辑于星期二\12点24分Ish-Horowicz-Burke柯斯克隆方案12本文档共41页；当前第12页；编辑于星期二\12点24分13本文档共41页；当前第13页；编辑于星期二\12点24分Bates-Swift柯斯克隆方案柯斯质粒载体c2XB具有两个被平末端限制酶SmaI分隔开来的cos位点。这些平末端在所用的条件下仅以极低的效率发生连接，因此可以有效的避免形成多个载体拷贝的重组子14本文档共41页；当前第14页；编辑于星期二\12点24分pWE和sCos系列的现代柯斯质粒特征：对未经大小选择的DNA进行简单克隆的多克隆位点；在克隆位点旁边的噬菌体启动子；克隆位点两侧的单一Not

I,SacI或SfiI位点，可将单一片段插入从载体上切除下来。如果需要向哺乳动物细胞转移基因，载体上还可以包含编码显性选择标记的哺乳动物表达元件。15本文档共41页；当前第15页；编辑于星期二\12点24分16本文档共41页；当前第16页；编辑于星期二\12点24分柯斯质粒的替代者BAC和PAC17本文档共41页；当前第17页；编辑于星期二\12点24分噬菌体Pl18本文档共41页；当前第18页；编辑于星期二\12点24分BAC系统(细菌人工染色体)19本文档共41页；当前第19页；编辑于星期二\12点24分利用重组酶的体内DNA重组技术20本文档共41页；当前第20页；编辑于星期二\12点24分载体的选择21本文档共41页；当前第21页；编辑于星期二\12点24分特殊用途载体可用于产生测序所需的单链DNA的载体表达载体制备RNA探针的载体最大量合成蛋白质的载体简化蛋白纯化的载体促进表达蛋白溶解的载体促进蛋白外运的载体合而为一：组合了多种特性的载体22本文档共41页；当前第22页；编辑于星期二\12点24分制备RNA探针的载体23本文档共41页；当前第23页；编辑于星期二\12点24分制备RNA探针所用的LITMUS载体的结构和用途24本文档共41页；当前第24页；编辑于星期二\12点24分25本文档共41页；当前第25页；编辑于星期二\12点24分表达载体Thebasesequenceofthe−10and−35regionsoffournaturalpromoters,twohybridpromoters,andtheconsensuspromoter.26本文档共41页；当前第26页；编辑于星期二\12点24分Structureofafactor-independenttranscriptionalterminator.27本文档共41页；当前第27页；编辑于星期二\12点24分影响克隆基因表达的因素28本文档共41页；当前第28页；编辑于星期二\12点24分对插入基因进行可控表达29本文档共41页；当前第29页；编辑于星期二\12点24分克隆到pET载体中的基因表达调控策略30本文档共41页；当前第30页；编辑于星期二\12点24分ControlofclonedgeneexpressionusingtheλcIpromoter31本文档共41页；当前第31页；编辑于星期二\12点24分RegulationofthepBADpromoter.32本文档共41页；当前第32页；编辑于星期二\12点24分简化蛋白纯化的载体Structureofavector(pBAD/His,InvitrogenCorporation)designedfortheexpressionofaclonedgeneasafusionproteincontainingapolyhistidinesequence.33本文档共41页；当前第33页；编辑于星期二\12点24分融合标签及其抗体34本文档共41页；当前第34页；编辑于星期二\12点24分Purificationofaclonedgeneproductsynthesizedasafusiontothebiotincarboxylasecarrierprotein(tag).35本文档共41页；当前第35页；编辑于星期二\12点24分内含肽，外含肽和蛋白切割36本文档共41页；当前第36页；编辑于星期二\12点24分与内含肽融合合成的克隆基因产物的纯化37本文档共41页；当前第37页；编辑于星期二\12点24分促进表达蛋白溶解的载体要减少包涵体的形成，可以