植物基因克隆的工具酶

关于植物基因克隆的工具酶第1页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三基因工程中的工具酶：应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取、重组DNA制备等过程中所需要的酶。第2页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第3页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三一、限制性核酸内切酶第一节

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列（4-8bp），并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。限制酶天然存在于细菌体内。（Restrictionendonuclease）第4页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三（一）寄主控制的限制与修饰现象（R/M体系）任何物种都有排除异物保护自身的防御机制，如人的免疫系统和细菌的限制与修饰系统，即限制酶与修饰酶组成的系统。早在20世纪50年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时被称作寄主控制的专一性。λ噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题。第5页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三这说明K菌株和B菌株中存在一种限制系统，可排除外来的DNA。10-4的存活率是由于宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。第6页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三宿主控制限制（host-controlledrestriction）：菌体在某一株细菌的生长能力在转移到另一株细菌宿主时，要受到一定限制。实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。第7页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三宿主控制修饰（host-controlledmodification）：用作繁殖噬菌体的感染宿主并不会产生DNA降解，这是因为它具有宿主控制性修饰的作用。甲基化是常见的修饰作用，通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。如A：N6-甲基腺嘌呤；C：5’-甲基胞嘧啶第8页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第9页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第10页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三（二）限制酶的发现20世纪60年代，人们就注意到DNA在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。1968年，首次从E.coliK中分离到限制酶；1970年，美国H.Smith偶然发现，流感嗜血杆菌能迅速降解外源的噬菌体DNA，其细胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，从而找到HindⅡ限制性内切酶。从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。EcoRⅠ是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：

5'G↓AATTC3'

3'CTTAA↑G5'第11页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三据统计：1986年：615种限制酶，98种甲基化酶1998年：1000种细菌或古细菌中存在3000多种酶，且200多种特异性。2006年：4583种酶，其中限制酶3773种，第12页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三命名原则：第一个字母（大写,斜体）：该酶来源的微生物属名；第二、第三个字母（小写、斜体）：微生物的种名；若该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。总之：限制酶由三部分构成（菌种名、菌系编号、分离顺序）（三）限制性内切酶的命名1973年Smith和Nathans提出有关限制酶命名规则的建议第13页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensae

dⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)（三）限制性内切酶的命名第14页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三举例EcoRIEscherichia属名Coli种类Ry13株系编号

若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第15页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制酶的生物学功能一般是保护宿主不受外来DNA的感染，可降解外来的DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶伴生的修饰酶是甲基转移酶，能保护自身的DNA不被降解。它们与对应的限制酶识别相同的序列，但其作用不是切割DNA，而是在两条链上对某个碱基进行甲基化。限制酶和甲基转移组成限制和修饰系统。（四）限制性内切酶的种类第16页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三I：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子双链，但它随机切割核苷酸的顺序，无专一性。Ⅱ：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，这种限制性内切酶是DNA重组技术中常用的工具酶。Ⅲ：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸不是特异性的。这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。（四）限制性内切酶的种类第17页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三性质酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ结构与功能三亚基多功能酶单一功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制作用的辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特异性位点序列特异性,非对称序列特异性,旋转对称序列特异性,非对称序列切割位点在距寄主特异性位点至少1kb的地方位于寄主特异性位点或其附近在距寄主特异性位点3´端24~26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割甲基化作用位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在DNA克隆中的用途无十分有用有用表2-1限制性内切酶的类型及其主要特征第18页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制性内切酶以双链DNA为底物，识别特定的核苷酸序列，切断特定位置的磷酸二酯链，产生具有3’-OH和5’-P的DNA片段。（五）限制性内切酶作用机制第19页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三限制性内切酶作用过程点击播放第20页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三（六）限制性内切酶的识别与切割1.在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子产生链的断裂2.识别由4-8个（多数4-6个）核苷酸组成的特定的核苷酸序列3.识别碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic），切点就在其内部。识别第21页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第22页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三回文结构（Palindromic）ABCC’B’A’A’B’C’C

BAABNB’A’A’B’NBA大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。第23页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制性内切酶切断DNA链上磷酸二酯键的位置一般在识别序列内部，如G↓GATCC，AT↓CGAT；也有少数在识别序列的两端如↓GATC，CATG↓。切割注意：环状DNA分子上，若某种限制性内切酶有n个识别序列，则完全切割后可获得n个片段。线状DNA分子，若某种限制性内切酶有n个识别序列，则完全切割后可获得n+1个片段。第24页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

第25页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三EcoRIPstI5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC...…5’不同核酸内切酶的特异识别位点5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’第26页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三AAGCTTTTCGAAAAGCTTTTCGAADNAABCDDNAHindⅢHindⅢ切割位点核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用第27页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三酶生物来源识别序列黏/平末端EcoRI大肠杆菌GAATTC黏末端BamHI淀粉芽孢杆菌GCATCC黏末端BalII枯草芽孢杆菌AGATCT黏末端PvuI普通变形菌CGATCG黏末端PvuII普通变形菌CAGCTG平末端HindIII流感嗜血杆菌RdAAGCCT黏末端HinfI流感嗜血杆菌RfGANTC黏末端Sau3A金黄色葡萄球菌GATC黏末端AluI藤黄节杆菌AGCT平末端TaqI水声栖热菌TCGA黏末端HaeIII埃及嗜血菌GGCC平末端NotI豚鼠耳炎诺卡氏菌GCGGCCGC黏末端SfiI镶边链霉菌GGCCNNNNNGGCC黏末端最常用的限制性内切酶的识别序列第28页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三切割方式平头末端（bluntendorflushend）经酶切所形成的末端具有互补碱基对完好的末端，称为平头末端。第29页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三粘性末端（cohesiveend）切割方式

大多数Ⅱ型限制性内切酶结合并切割的DNA序列是一种回文序列，经切割一端产生5´-磷酸突出的末端，另一端产生3´-OH突出的末端，即DNA片段双链的两个末端含有几个等长核苷酸碱基互补配对的单链末端，称为粘性末端。第30页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第31页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三部分常用的限制性内切酶第32页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第33页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第34页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三第35页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三有一些限制酶的识别顺序不是对称结构５’－CCGCTC－３’３’－GGCGAG－５’AccBSIBssSI５’－CTCGTG－３’３’－GAGCAC－５’第36页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三同裂酶（isoschizomers）

概念

用途

有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

有一些来源不同的限制性酶识别的是相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。第37页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三识别位点的序列相同同裂酶（Isoschizomers)①完全同裂酶（同序同切酶）识别位点和切点完全相同。

如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

第38页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

识别位点相同，但切点不同。

如XmaI和

SmaI。②不完全同裂酶（同序异切酶）：第39页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

用途

如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶，共同的靶序列是CCGG。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），HpaⅡ不能够切割它，而MspⅠ对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C残基甲基化与否都能够切割。*

现已研究发现，许多动物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG处以5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化产物就可以检测出甲基化的存在。第40页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三同尾酶（isocaudamer）

概念

与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。

常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

举例第41页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、Bgl

Ⅱ、BclI、Xho

Ⅱ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

Bgl

Ⅱ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第42页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

用途

由于同尾酶切割DNA后产生的是粘性末端，因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在基因克隆实验中是很有用处的。同尾酶（isocaudamer）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称为杂种位点（hybridsite）第43页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三5’-GATC----3’3’----CTAG-5’

Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。？5’-G3’-CCTAG

GATCT-3’

A-5’

BamHIBgl

Ⅱ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’

BamHIBglⅡSau3A第44页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三（七）Ⅱ型限制性内切酶的反应条件第45页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三（八）影响限制性内切酶活性的因素

酶的纯度

DNA样品的纯度

DNA的甲基化程度酶切反应的温度和时间

DNA分子的结构限制性内切核酸酶的反应缓冲液第46页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

高质量的限制性核酸内切酶，要求:

不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染;

长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降;

酶解的DNA片段连接后能重新被识别和切割等.

酶的纯度第47页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三1.DNA制剂中可能抑制限制性内切酶活性的物质:

蛋白质、酚、氯仿、酒精

乙二胺四乙酸（EDTA）

十二烷基硫酸钠（SDS）高浓度的盐离子等

DNA样品的纯度第48页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三2.提高限制性内切酶对低浓度DNA制剂反应效率的方法①增加内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些；②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释；③延长酶催化反应的保温时间。第49页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

DNA的甲基化

1.原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：甲基化酶：对自身DNA起修饰作用，从而使限制性内切核酸酶不能识别，保护自身DNA免受降解。限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNA，防御异源遗传信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切酶的活性第50页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三2.从大肠杆菌寄主细胞中分离而来的质粒DNA，通常都混有两种作用于特定核苷酸序列的甲基化酶：dam甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤残基甲基化。dcm甲基化酶：催化CCAGG或CCTGG中胞嘧啶残基甲基化。第51页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三3.基于基因工程

从以上知识可知：从正常大肠杆菌菌株中分离出来的质粒DNA，只能被限制性内切核酸酶局部消化，甚至完全不被消化。

因此，在基因工程中，为了避免产生上述问题，通常使用失去了甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。第52页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

酶切反应的温度

DNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。

但，大多数限制性核酸内切酶的标准反应温度都是37℃。第53页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三酶反应温度（℃）ApaⅠBanⅠBstEⅡMaeⅠMaeⅡMaeⅢSmaⅠTaqⅠ3050604550552565表2-2部分限制性核酸内切酶的最适反应温度第54页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

DNA分子结构DNA分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。

某些核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA高出许多倍，最高的可达20倍。第55页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

某些限制性内切核酸酶，对于同一DNA分子上不同位置的识别序列，切割效率明显不同。

DNA分子结构原因可能是侧翼序列的核苷酸成分的差异造的。

一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过10倍。第56页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分Tris-Cl：使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值范围内。对绝大数限制酶来说，最佳pH=7.4。MgCl2：保证酶活性的正常发挥。NaCl或KCl：同上。第57页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三β-巯基乙醇：防止限制酶的氧化（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定性）。牛血清白蛋白（BSA）：对某些限制酶是必需的，它是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.缓冲液的主要成分第58页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三2.缓冲液的分类

不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：低盐缓冲液（L）：10mmol/LNaCl

中盐缓冲液（M）：50mmol/LNaCl

高盐缓冲液（H）：100mmol/LNaCl

限制性核酸内切酶的反应缓冲液第59页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.星号活性（staractvity）

限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条件下测定的，当条件改变时，有些酶的识别位点也随之改变，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列，这种现象称为星号活性。①概念第60页，讲稿共74页，2023年5月2日，星期三

限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.星号活性（staractvity）①概念（以EcoRⅠ为例）