洁净区环境控制及微生物知识培训课件

洁净区环境控制及微生物

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2013.10洁净区环境控制及微生物

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2013.制药生产洁净控制主要:（一）人员控制系统（二）公用工程控制系统（三）设备控制系统（四）物料控制系统（五）生产过程控制系统（六）质量检测控制系统制药生产洁净控制相关术语洁净室(区)：需要对尘粒及微生物含量进行控制的房间(区域)。悬浮粒子：洁净室内悬浮在空气约在0.1µm至5µm之间的固体和液体粒子，用于空气洁净度分级。洁净度：按单位容积空气中某种粒子的数量来区分的洁净程度。相关术语洁净室(区)：需要对尘粒及微生物含量进行控制的房间(相关术语空气净化：去除空气中的污染物质，使空气洁净的行为.静态测试：指洁净厂房（区）的净化空气调节系统已处于正常运行状态，生产工艺设备已安装，没有生产活动且除了测试人员（不得超过2人）无操作人员在场的状态，测试记录和报告中应注明所测试的状态。动态测试：指洁净室已处于正常生产状态下进行的测试。相关术语常见微生物的存在环境G+球菌：人G+芽胞杆菌：不正确的清洁、空气G-杆菌：水、不良卫生、耐药菌株酵母菌：食物、不良卫生、空气霉菌；木料、食物常见微生物的存在环境G+球菌：人细菌的形态●球菌φ一般在1.0um（如四链球菌、八联球菌、葡萄球菌）；

●杆菌长1~3um、宽0.3~0.5um（大肠杆菌、芽孢杆菌）；●病毒个体最小，多数0.1um左右。●内毒素：革兰氏阴性菌死亡解体后，才显示出一系列的内毒素生物活性（耐热、可过滤、易吸附等）细菌的形态●球菌φ一般在1.0um（如四链球菌、八联球菌、粘质沙雷氏菌的菌落特征

沙门氏菌的菌落特征

铜绿假单孢菌的菌落特征

红酵母的菌落粘质沙雷氏菌的菌落特征沙门氏菌的菌落特征铜绿假单洁净环境监测指标及方法尘埃粒子数微生物数静压差温、湿度风量照度噪声洁净环境监测指标及方法尘埃粒子数洁净环境监测指标及方法静态测试：指洁净厂房（区）的净化空气调节系统已处于正常运行状态，生产工艺设备已安装，没有生产活动且除了测试人员（不得超过2人）无操作人员在场的状态，测试记录和报告中应注明所测试的状态。动态测试：指洁净厂房（区）的净化空气调节系统已处于正常运行状态，生产设备按预约的工艺模式运行并有规定数量的操作人员在现场操作的状态。

洁净环境监测指标及方法静态测试：确定关键点靠近产品的地方；与产品接触的表面；与产品接触的物品周围的表面；气流流型；活动频繁的地方；确定关键点靠近产品的地方；洁净环境监测指标及方法测试状态：对于单向流，测试空气净化系统至少运行10分钟后进行。对于非单向流系统，至少运行30分钟后进行洁净环境监测指标及方法测试状态：洁净环境监测指标及方法尘埃粒子数测定：每次生产前及一定的生产周期后须对清洁后的洁净室进行尘埃粒子数的检测，以评价和掌握洁净室尘埃粒子的含量。监测与产品接触的压缩空气和其他气体如氮气等.洁净环境监测指标及方法尘埃粒子数测定：洁净区尘埃粒子数标准洁净级别测试状态≥0.5μm粒子数测试状态标准纠偏限警戒限标准纠偏限警戒限A级静态352035202800000动态352035202800000B级静态352035202800000动态352000352000280000200020001600C级静态352000352000280000200020001600动态352000035200002800000200002000016000D级静态、动态352000035200002800000200002000016000洁净区尘埃粒子数标准洁净级别测试状态≥0.5μm粒子数测试状尘埃粒子监测周期及采样量洁净度级别采样量，L/次采样周期取采样次数A级5.661次/周每点取3次B级5.661次/周C级2.831次/周每点取3次D级2.831次/月每点取3次尘埃粒子监测周期及采样量洁净度级别采样量，L/次采样周期取洁净区微生物监测方法微生物测定：有两种方法，沉降菌测定和浮游菌测定。沉降菌测定：采用沉降法，即通过自然沉降的原理收集在空气中的生物性粒子于培养基平皿上，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度等级。洁净区微生物监测方法微生物测定：有两种方法，沉降菌测定和浮游洁净区微生物监测方法空气微生物监测---浮游菌和沉降菌孰优孰劣？

沉降菌测试属于被动式取样法，对空气环境破坏小放置时间长，可以做时间段的环境监控取样方法并不能给出定量的数据

空气浮游菌测试主动式采样法，定量且对微生物无选择性时间“点”的采样洁净区微生物监测方法空气微生物监测---浮游菌和沉降菌孰优孰沉降菌的监测方法步骤：在皿底标记取样点号、取样日期、时间，在取样点打开皿盖，皿底放在平面上，将皿盖斜靠在皿底边缘，保证皿盖不掉下来且尽可能少的覆盖培养基表面。测试结束后，小心盖上培养皿，传出洁净区。30-35℃的培养箱中培养3天。沉降菌的监测方法步骤：在皿底标记取样点号、取样日期、时间，在沉降菌的监测方法沉降菌监测的注意点：

摆放位置和高度（抑制物质的引入）采样本身引入的污染（外表清洁，培养基质量，摆放位置和人员）培养基的脱水问题（新鲜培养基和摆放时间）沉降菌的监测方法沉降菌监测的注意点：沉降菌（CFU）标准洁净度测试状态CFU/皿.0.5h测试状态CFU/皿.4h合格标准纠偏限警戒限合格标准纠偏限警戒限A级静态≤1﹤1/动态﹤1﹤1/B级≤1﹤1/553C级332505030D级1010810010080沉降菌（CFU）标准洁净度测试CFU/皿.0.5h测试CFU浮游菌的监测方法步骤：

检测设备：浮游菌采样器。采用计数浓度法，即通过收集悬游在空气中的生物性粒子于专门的培养基中，经若干时间，在适宜的生长条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，从而判断洁净环境内单位体积空气中的活微生物数，以此来评定洁净室（区）的洁净度等级。浮游菌的监测方法步骤：浮游菌的监测方法监测方法空气浮游菌取样器采样的位置和高度培养基的脱水问题采样操作对于生产环境的污染颗粒捕获率的变化Feller校验的重要性浮游菌的监测方法监测方法浮游菌的监测方法步骤:（同沉降菌)30-35℃的培养箱中培养3天。浮游菌的监测方法浮游菌标准洁净度级别测试状态浮游菌CFU/m3测试状态浮游菌CFU/m3合格标准纠偏限警戒限采样体积合格标准纠偏限警戒限采样体积A级静态﹤1﹤1/600L动态﹤1﹤1/1000LB级552600L101051000LC级808060400L10010080500LD级10010080100L200200160100L浮游菌标准浮游菌CFU/m3浮游菌CFU/m3合格标准纠偏限洁净室环境控制当空气洁净度要求为C级、D级时，采用非单向流，换气次数分别大于25次/小时和15次/小时.洁净室环境控制当空气洁净度要求为C级、D级时，采用非单向流，监测表面的微生物擦拭法：如棉签法、擦拭面积25cm2接触平皿法监测表面的微生物擦拭法：如棉签法、擦拭面积25cm2监测方法表面微生物监测和人员卫生监测接触碟取样适用于平整的规则性表面取样方法属于定量检测方法棉签取样适用于不规则表面取样方法属于定量检测方法监测表面的微生物监测方法监测表面的微生物洁净区表面微生物标准洁净级别设备、墙壁表面菌落数（CFU/皿）人员卫生（CFU/皿）洁净服与用具菌落数（CFU/皿）纠偏限警戒限纠偏限警戒限纠偏限警戒限A级1＜11＜11＜1B级113131C级533131D级108----洁净区表面微生物标准洁净设备、墙壁表面菌落数人员卫生（CFU洁净室环境控制压差的控制：洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净区之间的压差应当不低于10帕斯卡。必要时，相同洁净度级别的不同功能区域（操作间）之间也应保持适当的压差梯度。温湿度的控制：无特殊要求时，生产中洁净室内温度应严格控制在18～26℃、相对湿度控制在45%～65%。洁净室环境控制压差的控制：洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净洁净室环境控制压差测定：在不同级别相邻的两个房间安装压差表，每天进行记录温湿度测定：在洁净间内放置温湿度计，每天进行记录。风量的测试：采用风速仪对送风口的风速进行测试，通过风速和送风口的截面积计算出风量。通过风量就可以换算出房间的换气次数。另外洁净室环境评价指标还包括照度、噪声的测试。洁净室环境控制压差测定：在不同级别相邻的两个房间安装压差表，洁净室环境控制微生物的控制：

由于细菌依附在悬浮粒子上，微粒被过滤的同时，细菌也能被很好的滤掉。

1、空气净化系统良好的运转，控制洁净室环境中的微生物。2、采取有效的环境消毒措施。洁净室环境控制微生物的控制：洁净环境的控制空气过滤：洁净度的控制靠良好的空气净化设施，一般采用三级过滤。初效过滤器用于新风过滤中效过滤器用于高效过滤器之前高效过滤器主要对象是﹤

1.0μm的尘埃对细菌的穿透率为0.0001%，对病毒的穿透率为0.0036%，所以，通过高效过滤器的空气可视为无菌。洁净环境的控制空气过滤：洁净度的控制靠良好的空气净化设施，一洁净室环境控制日常消毒：

每天生产结束后，用75%乙醇或1.5‰新洁尔灭溶液等消毒剂擦拭设备、桌面、门窗、墙壁等。消毒剂及更换周期：

石炭酸、75％乙醇和新洁尔灭（0.15％）。75％乙醇和新洁尔灭（0.15％），每1个月交替更换使用。洁净室环境控制日常消毒：洁净区环境控制与评价原则制定和实施系统的环境监测方案•监控项目•取样位置和计划•现场监测方法和结果记录•微生物鉴别•偏差调查与纠偏措施•人员培训洁净区环境控制与评价原则制定和实施系统的环境监测方案洁净环境的控制减少洁净区操作人员对环境的影响：在药品生产过程中，人是最大的污染源，人的因素对保证产品质量至关重要重要。因此控制洁净区人员的多少、操作动作的幅度、工作服的式样、质地及穿戴等对微粒和细菌的含量都有明显的影响。洁净环境的控制减少洁净区操作人员对环境的影响：洁净环境的控制维护好洁净区的环境，是我们进入洁净区每个人员必须要坚持的，要严格控制洁净工作服的穿戴、清洗和灭菌周期；严格控制操作人员数量、约束人员的行为，保证洁净区的净化级别。养成良好的卫生习惯。不光是环境卫生还包括个人卫生和工艺卫生。洁净环境的控制维护好洁净区的环境，是我们进入洁净区每个人员必进入洁净区人员要求新进人员在岗人员患病健康检查上岗离岗治疗或限定工作岗位每年一次合格洁净区内个人卫生管理规程包装区内个人卫生管理规程工作服清洗消毒管理规程所有健康检查患病及治疗史均存入健康档案上岗前不合格进入洁净区人员要求新进人员在岗人员患病健康检查上岗洁净区卫生管理规程

药品生产车间、工序、岗位均应按生产和空气洁净度级别的要求制定清洁规程，内容包括：清洁方法、清洁程序、清洁的周期、使用的清洁剂或消毒剂、清洁工具的清洁方法和存放地点。洁净区卫生管理规程 药品生产车间、工序、岗位均应按生产和空气洁净区卫生管理规程除符合一般生产区要求外，还应做到每天全面擦试工作场所墙面、顶棚、照明、排风口及其他附属装置，定期对室内进行消毒，按SOP规定要求对环境检测尘埃粒子、沉降菌、浮游菌数，并有相关记录。洁净区卫生管理规程除符合一般生产区要求洁净区卫生管理规程为有效地防止和避免因设备功能不正常或设备容器未经清洁、保养而对药品生产和质量的造成污染，所有设备应建立书面的设备维护和清洁规程、与药品直接接触的设备表面应光滑、平整、易清洗消毒、耐腐蚀，不与药品发生化学变化或吸附药品。洁净区卫生管理规程为有效地防止和避免因设备功能不正常或设备容洁净区卫生管理规程人是药品生产的最大污染源之一，进出洁净区的人员必须严格按工艺要求的净化程序进出。传染病患者、健康的传染病病毒携带者、体表有伤口者、皮肤病患者及药物过敏者不得从事直接接触药品的生产操作；有呼吸道感染、肠炎和皮肤病的人员不得进入洁净。洁净区卫生管理规程人是药品生产的最大污染源之一，进出洁净区的洁净区卫生管理规程进入洁净区的人员不得不得化妆，不得涂抹手及脚指甲油，不得接种假睫毛，头发不得留过肩。洁净区操作人员不得佩戴饰物、手表，不得将手机、钥匙及一切与生产无关的物品带入到洁净区。D级洁净区岗位人员不得穿洁净衣服到一般生产区。洁净区卫生管理规程进入洁净区的人员不得不得化妆，不得涂抹手及洁净区卫生管理规程洁净区的人数应按要求控制（标示牌），操作和行动等要进行自我约束。非本岗位人员进入洁净区（包括维修、辅助人员）应定期进行卫生和微生物学基础知识、洁净作业等方面的培训及考核。非本岗位人员进入洁净区要严格按规定程序进出、作业，并有登记记录。洁净区卫生管理规程洁净区的人数应按要求控制（标示牌），操作和洁净区卫生管理规程

工作服应制定清洗周期，工作服包括服装和一切用于包裹头、脸、手臂等的遮护用品。不同空气洁净度级别使用的工作服应分别清洗、整理，必要时消毒或灭菌。工作服洗涤、灭菌时不应带入附加的颗粒物质和纤维毛。洁净工作服的质地应光滑、不产生静电、不脱落纤维和颗粒物质。无菌工作服必须包盖全部头发、胡须及脚部，并能阻留人体脱落物。洁净区卫生管理规程工作服应制定清洗周期，工洁净区卫生管理规程

D级洁净区工作服每两天清洗一次；A级、B级及C级洁净区工作服每班清洗并灭菌，超过48小时后重新灭菌；

A级、B级及万级洁净区的工作服只能使用一次，下次使用必须重新洗消灭菌。洁净区卫生管理规程D级洁净区工作服每两天清洗一次洁净室清洁三原则洁净室清洁三原则洁净室清洁三原则原则一：用灭菌的纯化水或注射用水和新鲜过滤得清洁剂：所有过滤的清洁剂必须盛装在清洁并灭过菌的容器中，并正确贴签；把预先过滤的清洁剂存放在洁净室中可减小污染的风险。洁净室清洁三原则原则一：用灭菌的纯化水或注射用水和新鲜过滤得洁净室清洁三原则原则二：使用清洁的工具和物料以避免将污染物带入洁净室：不锈钢表面较好，塑料表面易划痕并滞留尘粒和微生物；不要使用带木柄的清洁工具，因其易脱落尘粒；毛刷易断且滞留微生物，不宜使用；拖布和抹布应用与洁净室相适应并不易产生脱落纤维的物料制成；抹布应粘附尘土和细菌，且只使用一次；洁净室使用的真空吸尘器应安装HEPA过滤器并定期测试。洁净室清洁三原则原则二：使用清洁的工具和物料以避免将污染物带洁净室清洁三原则原则三：清洁过程中不得增加洁净室的污染物：正确的清洁顺序；正确的行为。洁净室清洁三原则原则三：清洁过程中不得增加洁净室的污染物：洁净区清洁频率取决于对洁净室尘粒和微生物监测的结果（空气、表面）；符合GMP要求；分装区域每一批分装后都应及时进行清洁；所有清洁区域的地面、桌面、设备表面每天至少清洁一次.洁净区清洁频率取决于对洁净室尘粒和微生物监测的结果（空气、表常用的灭菌方法2015版：最终灭菌法：湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法。

非最终灭菌法：过滤除菌法、无菌生产工艺。常用的灭菌方法2015版：常用的灭菌方法一、湿热灭菌法：本法系指物质在灭菌器内利用高压蒸汽或其他热力学灭菌手段杀灭细菌，灭菌能力甚强，为热力学灭菌中最有效及用途最广的方法。药品、药品的溶液、玻璃器械、培养基、无菌衣、敷料以及其他遇高温与湿热不发生变化或损坏的物质，均可用本法灭菌。用于湿热灭菌法的生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌、生孢梭菌,培养:56℃/48h.灭菌效果验证应进行满载热分布/热穿透、细菌挑战性、空载试验、热穿透F0值。常用的灭菌方法一、湿热灭菌法：本法系指物质在灭菌器内利用高常用的灭菌方法二、干热灭菌法：本法系指物质在干燥空气中加热达到杀灭细菌的方法。160～170℃2小时以上，

170～180℃1小时以上，

250℃45分钟以上（除热源）。用于干热灭菌法的生物指示剂：枯草芽孢杆菌孢子

三、除菌滤过法：本法系利用细菌不能通过致密具孔滤材的原理，除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌从而达到无菌要求。过滤器材通常有滤柱、滤膜等。

用于滤过灭菌法的生物指示剂：黏质沙雷菌、缺陷假单孢菌常用的灭菌方法二、干热灭菌法：本法系指物质在干燥空气中加热常用的灭菌方法四、辐射灭菌法：

本法系通过将最终产品的容器和包装暴露在由适宜放射源（通常用Co60

）辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的射线中，达到杀灭细菌的目的。

用于辐射灭菌法的生物指示剂：短小芽孢杆菌孢子五、环氧乙烷灭菌法：本法系将产品暴露在充有环氧乙烷的环境中，使之达到灭菌的目的。本方法适用于气体中稳定的物质。用于环氧乙烷灭菌法的生物指示剂：枯草芽孢杆菌孢子常用的灭菌方法四、辐射灭菌法：常用菌种保藏方法1、传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、庖肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4~6℃冰箱内保存。2、液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。常用菌种保藏方法1、传代培养保藏法3、载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。4、冷冻保藏法可分低温冰箱（－20~－30℃，－50~－80℃）、干冰酒精快速冻结（约－70℃）和液氮（－196℃）等保藏法。5、冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（－70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。3、载体保藏法各类菌种保藏条件及时间菌种培养基保存温度传种时间细菌一般多用于营养琼脂或根据菌种规定选用培养基4~6℃芽孢杆菌3~6个月，其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6℃一般4~6个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等4~6℃每4个月移植一次（每2个月移植一次）各类菌种保藏条件及时间菌种培养基保存温度传种菌种的传代方法1：菌斜面菌斜面（保存）；方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面；常用分离平板：大肠埃希菌——EMB琼脂平板；铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基；金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基；沙门菌——SS琼脂平板。菌种的传代方法1：菌斜面菌斜面（保存）；对照用菌液制备菌种

工作菌种培养基菌悬液对照菌液大肠杆菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液沙门菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液铜绿假单胞菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液生孢梭菌硫乙醇酸盐培养基硫乙醇酸盐培养基0.9%氯化钠溶液白色念珠菌真菌琼脂斜面真菌培养基0.9%氯化钠溶液