日本血吸虫感染小鼠后h1h2细胞因子的动态变化

日本血吸虫感染小鼠后h1h2细胞因子的动态变化

在血液吸虫感染小鼠后的慢性疾病过程中，以头皮屑为基础的免疫反应呈现复杂的免疫反应，并以卵石肉芽为基本病变的免疫病理反应。根据越来越多的实验，th1和th2的免疫转移在制定和发展卵石肉芽肿疾病方面发挥着重要作用。通过调节th1和th2的免疫转移，可以预防和控制卵石肉芽肿的病变性血吸虫疫苗的开发，这是最近趋势阐明寄生虫疾病的热点之一。本文观察单、双性日本血吸虫感染小鼠后Th1和Th2细胞因子水平的动态变化,探讨日本血吸虫不同免疫原对Th1/Th2免疫偏移的影响及与虫卵肉芽肿形成的相关性,深入阐明日本血吸虫免疫应答及免疫病理机制。1材料和方法1.1u3000小球虫感染日本血吸虫尾C57BL/6小鼠100只,雌性,8w龄(中科院上海实验动物中心提供),阳性钉螺(由浙江省医学科学院寄生虫病研究所提供),小鼠随机分为3组,组Ⅰ以多只阳性钉螺混合逸出的尾蚴感染小鼠,组Ⅱ以单只阳性钉螺逸出的尾蚴感染小鼠,组Ⅲ小鼠先单性感染8w后再双性感染,每鼠每次均感染新鲜逸出日本血吸虫尾蚴30±2条。小鼠分别于感染后4、6、8、10和12w,解剖小鼠冲虫确定单、双性感染并观察肝脏肉芽肿病变情况。1.2清髓细胞的制备小鼠分别于感染后0、4、6、8和12w,每次各剖杀5只,无菌取脾,磨碎后使细胞通过不锈钢丝网筛,成单个细胞,悬浮于PRMI1640培养液中,离心并弃上清后,加入0.87%氯化铵溶解红细胞,用PBS洗涤2次,再加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,将细胞悬液加到无菌培养皿中,37℃,静置90min,吸取非贴壁细胞,用PBS洗涤2次,即为去单核的脾淋巴细胞,经1%台蓝兰染色后计数活淋巴细胞,并用含10%小牛血清的PRMI1640培养液调整细胞浓度至3×106/ml。每次用正常小鼠2只,同上制备正常未感染小鼠脾淋巴细胞悬液作对照。1.3离心测定sea参考文献方法,将脾淋巴细胞加至24孔细胞培养板中,1ml/孔,每份样本设3孔,每孔分别加日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)20μg/ml和ConA5μg/ml,置37℃,5%CO2孵箱培养48h后离心取上清液,-30℃保存待测。用ELISA双抗夹心法检测试剂盒(均购自法国DICLONE公司)测定上述小鼠感染后不同时期脾淋巴细胞诱生的Th1细胞因子IL-2和IFN-γ,Th2细胞因子IL-4水平。根据每块酶标板上的标准曲线的OD值,判断待测样品中特定细胞因子的量(pg/ml)。1.4处理数据每份样本设3孔,取其平均值,以ˉx±s表示,数据比较作t检验。2模型小鼠血吸虫感染后th1和th2细胞因子发生变化以单只阳性钉螺逸出的日本血吸虫尾蚴感染小鼠6-12w后解剖小鼠,冲虫观察结果,虫体细小未成熟,均为单性,小鼠肝脏表面光滑无结节。细胞因子检测结果如图1～3所示,在感染后6～12w小鼠脾淋巴细胞经SEA刺激后培养上清中可测出一定水平的Th1细胞因子IL-2和IFN-γ,但其表达水平无明显动态变化,而Th2细胞因子IL-4则未测出,因单性血吸虫感染小鼠无虫卵产生,提示Th1淋巴细胞亚群的活化可能是由虫体抗原诱导的。ConA组上清中Th1和Th2细胞因子均可测出,但单性感染时经ConA刺激后可表达较高水平的Th1细胞因子,其动态变化与双性感染组也基本一致,而Th2细胞因子动态变化与双性感染组不同,在感染后12w时,IL-4表达水平明显低于双性感染组(P<0.01)。从图1～3显示,经SEA刺激脾淋巴细胞,双性感染小鼠Th1细胞因子IL-2和IFN-γ在感染后4～6w开始上升,8w达高峰,随后下降,Th2细胞因子IL-4在感染后8w时迅速上升且随着感染时间延长而明显升高,实验结果提示,在日本血吸虫感染早期主要表现为Th1优势应答,而在虫体成熟产卵后则主要表现为Th2优势应答,表明日本血吸虫不同免疫原对Th1/Th2免疫偏移的影响不同,虫体抗原可能主要诱导Th1优势应答,而虫卵抗原可能主要诱导Th2优势应答。ConA组上清中Th1和Th2细胞因子均在感染前即可测出,感染后其动态变化与SEA组相似但表达水平明显高于SEA组。单性感染后8w双性再感染小鼠4w时,解剖小鼠即可见雌雄合抱的成熟虫体,小鼠肝脏表面已可见少量虫卵肉芽肿结节,从图1～3进一步显示,再感染4w时,SEA刺激脾淋巴细胞即可诱生出高水平的细胞因子,且均随着感染时间的延长而明显升高,提示双性血吸虫感染小鼠后虫体发育成熟并合抱产卵,是诱导小鼠产生明显的免疫应答及导致虫卵肉芽肿免疫病理反应的关键因素。ConA组上清中Th1和Th2细胞因子动态变化与SEA组基本一致,但表达水平明显高于SEA组。3不同感染类型小鼠免疫原th1和th2的免疫反应正常状态下,体内Th1和Th2细胞功能处于动态平衡,维持正常的细胞和体液免疫功能,而抗原的种类、剂量和细胞因子等多种因素均能调节其动态平衡。已有研究表明,在曼氏血吸虫感染小鼠中,Th1/Th2细胞在血吸虫病的发生、发展及免疫调节中均起重要作用,在感染早期(成虫产卵前)以Th1优势应答为主,而虫卵肉芽肿病变形成时则偏移为Th2优势应答。本研究表明,单性日本血吸虫尾蚴感染小鼠后,主要诱导小鼠产生Th1优势应答,但Th1细胞因子IL-2和IFN-γ的表达水平较低;双性感染小鼠则在感染6w前以Th1优势应答为主,而在感染8～12w则偏移为Th2优势应答,与上述曼氏血吸虫的研究报道相似,因Th1优势应答出现在单性感染及双性感染早期,此时无虫卵产生或虫卵尚未成熟分泌可溶性虫卵抗原(SEA),提示其可能主要由虫体抗原所诱导,而Th2优势应答出现在感染后8w,此时小鼠肝内呈现明显的虫卵肉芽肿病变,提示Th2优势应答可能主要由虫卵抗原诱导;单性感染后8w双性再感染4w时,解剖小鼠即可见雌雄合抱的成熟虫体,小鼠肝脏表面已可见少量虫卵肉芽肿结节,经SEA刺激脾淋巴细胞,此时即可诱生出高水平的Th1和Th2细胞因子,且均随着感染时间的延长而明显升高,提示双性血吸虫感染小鼠后虫体发育成熟并合抱产卵,是诱导小鼠产生强烈对虫卵抗原的免疫应答及导致虫卵肉芽肿免疫病理反应的关键因素。本实验结果中,在三种不同感染情况下,ConA组上清中Th1和Th2细胞因子动态变化与SEA组基本一致,但表达水平明显高于SEA组。推测可能是由于SEA仅刺激特异性的,经虫卵抗原致敏的T淋巴细胞亚群活化,而ConA作为一种有效的T淋巴细胞有丝分裂因子,能刺激多种T淋巴细胞亚群的活化,表达高水平的细胞因子,但实验结果中可发现,在小鼠感染后8w时,即肉芽肿反应高峰期,ConA与SEA诱导的细胞因子水平差异明显缩小,表明在这个时期日本血吸虫卵抗原特异性的T淋巴细胞亚群活化程度较高,表达了较高水平的细胞因子。此外,在不同感染情况下,小鼠脾淋巴细胞对ConA刺激的反应性也有所不同,单性感染时经ConA刺激后可表达较高水平的Th1细胞因子,其动态变化与双性感染组也基本一致,而Th2细胞因子动态变化与双性感染组不同,在感染后12w时,IL-4表达水平明显低于双性感染。进一步提示,单、双性日本血吸虫感染小鼠后T淋巴细胞受不同的免疫原致敏后其免疫应答有所不同。本研究初步阐明了Th1