《基因工程》-第七章 重组子选择筛选与分析

《PrincpleandTechnologyofGeneticEngineering》

《基因工程原理》1第七章重组子选择、筛选和分析（TheSelection,screeningandanalysisofrecombinants）教学目的与要求：1)Geneticselectionandscreeningmethods2)Screeningclonebanksbynucleicacidhybridization（Southernblotting，Northernblotting）3)Immunologicalscreeningforexpressedgenes(Westernblotting)4)Analysisofclonedgenes(Restrictionmapping,DNAsequencing)2第一节转基因筛选和选择的方法转化子：将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子重组子：含有重组DNA分子的转化子被称为重组子阳性克隆子：如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。克隆子的筛选或选择：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。1．根据载体选择标记初步筛选转化子载体DNA分子上通常携带了一定的选择遗传标记基因，可进行转化子或重组子初步筛选。做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。对于受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。

（1）抗药性筛选法（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法（1）抗药性筛选这是利用载体DNA分子上的抗药性筛选标记进行筛选的方法。主要用于重组质粒DNA分子的转化子筛选。重组质粒DNA分子携带特定的抗药性选择标记基因，在含有相应选择药物的选择培养基上正常生长。①氨苄青霉素（ampicillin，Ap或Amp）:含bla基因的菌体能转译

-丙酰胺酶(

-lactarnase)，可降解Ap。②氯霉素(chloramphenicol,Cm或Cmp):含cat基因的菌体能转译氯霉素乙酰转酰酶(chloramphenicolacetyltransferase)，使Cm乙酰化而失效。③卡那霉素(kanamycin,Kn或Kan):含Kan抗性基因菌体转译一种能修饰Kn的酶，阻碍Kn对核糖体的干扰。四环素(tetracymic,Tc或Tet):含Tc抗性基因的菌体转译一种能改变细菌膜的蛋白，防止Tc进入细胞后干扰细菌蛋白质的合成。⑥链霉素(strentomycin,Sm或Str):含Str抗性基因的菌体转译一种能修饰Sm的酶，抑制Sm与核糖体结合。（2）插入失活筛选法外源DNA片段插入载体DNA的BamHI位点，导致载体Tcr基因失活，重组子具有AprTcs的遗传表型，而非重组子则为AprTcr，重组子只能在Ap板上形成菌落而不能在Tc板上生长；非重组子却在两种平板上都能生长。

β-galactosidaseX-galIPTGblue-coloured（3）插入表达筛选法插入表达法是利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。例如pTR262质粒载体，其Tcr基因的上含有一段

噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片断插入CI基因的HindIII或BglI位点上时，CI基因失活，Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型，含有外源DNA插入片断的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。2．利用报告基因筛选植物转化细胞在植物转基因研究中，载体携带的选择标记基因（selectivegene）经常称为报告基因(reportorgene)，常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他特殊产物的基因等。（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞①新霉素磷酸转移酶（neomycinephosphotransferase-II,NPTII）基因新霉素(neomycin)与卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素和G418等均属于氨基环醇类的抗生素，它们的结构相似，能抑制原核细胞核糖体70S起始复合物的形成，从而阻碍了蛋白质的合成，进一步抑制了细胞的生长。NptII基因催化ATP上

-磷酸基团转移到上述抗生素分子的某些基团上，从而阻碍抗生素分子与靶位点的结合，并使抗生素失活。因此，在含有上述抗生素的选择培养基上培养植物转化材料仅有携带NptII基因的转化植物细胞才能存活下来。

②潮酶素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因某些植物细胞株系（如水稻）对卡那霉素具有一定的抗性，利用卡那霉素筛选NptII基因转化体时假阳性率高，这时可采用Hpt报告基因进行筛选。潮霉素原是一种链霉菌的产物，通过与70S和50S核糖体的结合来抑制许多原核生物与真核生物的生长。HPT酶能催化ATP上的

-磷酸基团转移至潮霉素分子上而使之失活。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。③氯霉素乙酰转移酶（chloraphenicolacetyltransferase,CAT）基因氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，从而阻断肽键的形成并最终抑制细胞生长。CAT基因催化乙酰辅酶A转乙酰基，使氯霉素失活。（2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞①

-葡萄糖酸苷酶（

-Glucuronidase,GUS）基因作为一种水解酶，转化植物细胞所产生的

-葡萄糖酸苷酶能够催化某些特殊反应的进行，通过荧光、分光光度和组织化学的方法对这些特殊反应产物的检测即可确定Gus报告基因的表达情况，以此区分转化子和非转化子。②荧光素酶（luciferase,LUC）基因LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。1985年Luc基因首次被克隆。该酶在激活因子Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，同时发射光子。③冠瘿碱（opine）合成酶基因冠瘿碱合成酶基因主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成酶基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。冠瘿碱合成酶基因含有类似真核生物的启动子和poly(A)序列，植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离菲醌荧光染料染色，可以方便地观察到反应产物的生成。（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞Bar基因是1987年从水链霉菌中分离出来的，它编码的PPT-乙酰转移酶(PAT)能够解除非选择性除草剂的毒性。PPT是L-谷氨酸的类似物，能强烈抑制谷氨酰胺合成酶(Gs)的活性，而谷氨酰胺合成酶一旦受到抑制，将会导致植物体内氨的迅速积累，并使植株死亡。Bar基因的表达产物PAT通过对PPT的乙酰化从而解除PPT的毒性，可以使转化植物细胞产生对除草剂的抗性。3．利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptII)基因也可作为遗传选择标记用于哺乳动物转基因细胞的筛选，除此以外，常用的标记基因还有：胸酰核苷激酶基因(tk)、二酸叶酶还原酶基因(dhfr)及细菌的黄呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等4．营养缺陷型检测法根据目的基因在受体细胞中表达产物的性质，筛选含目的基因的克隆子。5．形成噬菌斑筛选法对于系统而言，外源DNA插入

噬菌体载体后，重组DNA分子大小必须在野生型

DNA长度的78%~105%范围内，才能在体外包装成具有感染活性的噬菌体颗粒，导入受菌体后，转化子在培养基平板上被裂解形成噬菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。取代型

载体，则噬菌斑中的

噬菌体即为重组子，产生噬菌斑。使用插入型

载体，筛选重组子可以利用

载体上的筛选标记基因，如lacZ’等。当外源DNA片段插入lacZ’基因内时，重组子噬菌斑无色透明，而非重噬菌斑则呈蓝色。小结：1．根据载体选择标记初步筛选转化子（1）抗药性筛选法（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法2．利用报告基因筛选植物转化细胞（1）利用抗生素报告基因筛选植物转化细胞（2）利用生化报告基因筛选植物转化细胞（3）利用抗除草剂基因筛选转基因植物细胞3．利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞4．营养缺陷型检测法5．形成噬菌斑筛选法第二节依赖于重组子结构特征分析筛选法快速裂解菌落鉴定分子大小。根据有外源DNA片段插入的重组质粒与载体DNA之间大小的差异来区分重组子和非重组子。

一、限制性核酸内切酶酶解分析法从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，然后用限制性核酸内切酶酶解，通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。二、利用PCR方法筛选确定重组子（Othergeneticselectionmethods：PCR）通过插入位点两侧已知序列互补的引物，以从初选出来的阳性克隆中提取的少量质粒DNA为模板进行PCR反应，通过对PCR产物的电泳分析就能确定是否是重组子菌落。

图7-4转基因植株中Gus基因的PCR检测（PCRanalysisofGusinputativetransgenicplantlets），M,DNAmarker;P,以PCAM-Gus1质粒为阳性对照;CK1,以水为模板的阴性对照;CK2,以未转基因植株为阴性对照;1-6，转基因植株。Template:coloniesDenaturationat95℃60sPrimerannealingat55℃45s

Extensionat72℃120s1234√√√√1234Thermal

cyclerPCR37℃incubate5M12345√√23PrepareplasmidfornextanalysisUseofPCR第三节核酸分子杂交检测法nucleicacidhybridization一、分子杂交定义与原理分子杂交（molecularhybridization）：指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。

核酸分子杂交操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针

DNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC

Southernblotting（Southern印迹杂交法）Northernblotting（Northern印迹杂交法）Spotblothybridization(斑点杂交)colonyhybridization（菌落杂交）Nucleicacidhybridizationinsitu（原位杂交）DNAarray(DNA点阵)DNAchip(DNA芯片技术)常用核酸杂交方法：二、核酸杂交探针1.杂交探针：是指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并可通过适当标记进行检测。放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针。1）DNA探针优点：探针多克隆在质粒载体中，制备和使用方便。相对RNA探针，其不易降解。DNA探针标记方法较成熟，如缺口平移，随机引物法等，同位素和非同位素标记。cDNA探针：cDNA（complementaryDNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。cDNA探针是目前应用最为广泛的一种探针。以反转录酶制备，应用于高丰度mRNA的cDNA克隆筛选。2）RNA探针RNA探针是一类很有前途的核酸探针，主要用于研究目的，而不是用于检测。RNA是单链分子，它与靶序列的杂交反应效率极高。3)人工合成的寡核苷酸探针寡核苷酸探针的核苷酸序列是根据目的蛋白的一小段已知氨基酸序列推导合成出来的，长度一般为10~30bp，甚至可达50bp。要考虑遗传密码子的简并性。用于基因组DNA文库或cDNA文库的筛选。2.探针标记物1）放射性标记物常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等。2）非放射性标记物生物素（biotin）是一种水溶性维生素，又称维生素H。分子经化学修饰后可携带活性基因，能与核苷酸发生偶联，使核苷酸具有生物素标记。标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和系统检出，也可通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统检出。地高辛（digoxigenin，DIG）是一种类固醇类的半抗原，又称为异羟基洋地黄毒苷配基，该配基通过一个由11个碳原子组成的接连臂与尿嘧啶相连，形成地高辛标记的尿嘧啶核苷酸。利用抗地高辛抗体上带有的酶标记进行探针检测。荧光素（fluorescein）是一类能在激发光作用下发射出荧光的物质，包括异硫氰荧光素、羟基香豆素、罗达明等。荧光素与核苷酸结合即可作为探针标记物，主要用于原位杂交检测。3.Threemethodsforradiolabellingofnucleicacids1）EndlabellingDNA（末端标记法）UsingthepolynucleotidekinasetotransfertheterminalphosphategroupofATPonto5’-hydroxylterminiofnucleicacidmolecules.①磷酸酶将5‘磷酸基团转换成羟基②在PNK（多聚苷酸激酶）作用下，将ATP中的磷酸基团转移到DNA分子的5’-OH位置。ATP中的γ的磷酸是用32P进行标记的OHOHHOHOOHOHHOPNKATP5’3’3’5’2)LabellingDNAbyNicktranslation用低浓度的DNaseI.将DNA双链切出切口

用DNApolymeraseI补平缺口3’5’5’3’▲NickSiteofNick3’5’5’3’▲DNApolI(a)Asingle-strandnickisintroducedintothephosphodiesterbackboneofaDNAfragmentusingDNaseI(b)DNApolymeraseIthensynthesisesacopyofthetemplatestrand,degradingthenon-templatestrandwithits5’-3’exonucleaseactivity.[α-32P]dNTPwereincorporatedintothenewlysynthesisedstrand.3)Labellingnucleicacidsbyprimerextension

引物扩增法DNAisdenaturedbyheating3’5’5’3’3’5’3’5’5’HO3’5’5’DNApolI(Klenow)TheoligonucleotideprimersannealedtothesinglestrandDNAsTheKlenowfragmentofDNApolymerasesynthesiseacopyofthetemplate,primedfromthe3’-hydroxylgroupoftheoligonucleotide.IfalabelleddNTPissuppliedandisincorporated,theradiolabellingDNAwillbeproduced三、SouthernblottingSouthern杂交是由E.Southern于1975年首先建立并使用的。（1）原理：是具有同源性的两条核酸单链在一定条件下（适当的温度和离子强度等）按碱基互补原则退火形成特异性双链。（2）基本步骤：质粒或基因组DNA酶切后经琼