第六章-免疫组织化学

第六章免疫组织化学

1.1概念

免疫组织化学（immunohistochemistry）:

将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。第一节概述

1.2与组织化学的关系

从广义上理解：免疫组织化学为组织化学的分支。不同点：

组织化学的局限性：只能识别细胞或组织中核酸、蛋白质、酶、多糖、脂肪等，对免疫活化的大分子不能特异识别；方法上繁锁，不易掌握。

免疫组化的优点：能识别细胞或组织中蛋白质、脂、多糖类及小分子肽类。只要理论上具有抗原性，可以制备出相应抗体，就可以示踪定位，因此其待检物质广泛；方法上“一通百通”。1.3免疫组化在生物学中的应用

第二节

免疫组织化学的理论基础

2.1抗原2.1.1定义抗原(antigen，Ag)是一类在合适条件下，能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（包括抗体和效应细胞）在体内和（或）体外发生特异性结合反应的物质，它具有免疫原性和反应原性。免疫原性指的是它能刺激机体免疫系统产生免疫应答；反应原性指的是它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性地结合而发生反应。2.1.2分类

完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗原。

半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。2.1.3抗原的特异性抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特异性。这是由抗原分子表面具有化学活性的基团—抗原决定簇的性质、数目和空间构型决定的。抗原决定簇能被免疫活性细胞所识别，能与相应抗体的可变区结合。

2.1.4抗原的异物性

抗原化学结构必须与宿主自身物质的化学结构相异。

①异种物质。如鸭血清蛋白对于兔为强抗原，对于鸡则为弱抗原。②同种异体物质。如人类的ABO血型的抗原物质；③自身抗原。如被血——睾屏障所严密封闭的精子所含的物质。

2.2抗体

2.2.1定义抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激后，通过体液免疫应答，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性地结合的球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，存在于血液、淋巴液和组织液中。2.2.2结构抗体的基本结构由四条肽链对称排列组成，即两条相同的重链和两条相同的轻链。可变区与稳定区抗原与抗体的结合具有高度特异性，抗体结合抗原的不同特异性，取决于轻链和重链的可变区氨基酸的种类和顺序的不同。2.2.3特异性2.2.4抗体的分类目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。

多克隆抗体（第一代抗体）

将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（多数抗血清系由家兔制得）。

单克隆抗体（第二代抗体）

由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称为单克隆抗体，具有特异性强、纯度高的特点。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体（多数单克隆抗体由小鼠制备）。

基因工程抗体（第三代抗体）

将对基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体。第三节

免疫组化染色方法及原理

3.1.1标记抗体法（荧光素标抗体法或酶标抗体法。1941年Coons建立了荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体。60年代Nakane建立了酶标记抗体技术3.1.1.1直接标记法直接用荧光素或辣根过氧化物酶标记特异性抗体，与组织切片中相关抗原结合，用荧光/普通显微镜识别荧光所在的部位或酶显色的部位，以确定抗原所在的部位。该方法简单，但购买标记特异性抗体较困难，目前已经较少使用。

直接标记法3.1.1.2间接标记法将未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中抗原相结合，为了观察其结合部位，用荧光素或HRP标记第二抗体即标记在抗第一抗体的免疫球蛋白上再与第一抗体结合，如第一抗体为兔血清，第二抗体必须为其他动物抗兔的免疫球蛋白抗体。间接标记法优点：只要不同的第一抗体均来自同一种属，同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。缺点：酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性、抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。3.1.2非标记抗体酶法70年代Sternberger改良并建立了辣根过氧化物酶---抗过氧化物酶复合物法（PAP）技术。

辣根过氧化物酶（HRP）是从辣根中提取的，分子量为40000，等电点3～9，最适PH为5，它的底物是3，3ˊ-二氨基联苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。

HRPDAB+H2O2棕黄色产物PAP法基本原理:

3.1.3亲和免疫细胞化学技术卵白素（Avidin）:又称抗生物素、亲和素，具有4个与生物素亲和力极强的结合点。链霉亲和素（strept

avidin）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，和亲和素一样，也有4个生物素结合位点。生物素（Biotin）:维生素H，是一种小分子的维生素。抗生物素具有4个与生物素亲和力极强的结合点，这种亲和力较抗原抗体的亲和力高100万倍，而且不影响彼此的生物学活性，同时生物素与抗生物素都具有与其他示踪物质如荧光素、铁蛋白和HRP相结合能力，由此建立了抗生物素－生物素免疫染色系统，包括抗生物素－生物素－过氧化酶复合物技术（ABC）及链霉亲合素—生物素－过氧化酶（或碱性磷酸酶）合复技术（SABC）。3.1.3.1ABC法：亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法

3.1.3.2BRAB法：桥连抗生物素－生物素法：3.1.3.3LSAB法：

标记链霉抗生物素－生物素法，又称链霉亲合素酶结合法（strepavidinperoxidaseconjgatedmethod,S-P法）,即采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连接的过氧化物酶来测定细胞和组织中的抗原。第四节

免疫组织化学的基本技术（1）

4.1组织材料的处理

固定液的选择及固定的时间长短对实验结果有很大的影响。一般采用10%中性福尔马林液（石蜡切片）和丙酮（冰冻切片）固定。组织材料的处理是获得良好免疫组化结果的前提，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失，不扩散和不被破坏。4.2切片前的准备工作

4.2.1载玻片、盖玻片处理

清洁液浸泡24小时后依次自来水、双蒸馏水洗，95%酒精浸泡2小时，擦拭干净。防脱片处理：将干燥、干净的玻片放入多聚赖氨酸溶液中浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥备用。4.2.2常用试剂配制

0.05%-0.1%胰蛋白酶取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml0.05%或0.1%PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。4%胃蛋白酶取4g胃蛋白酶加入到100ml0.1mol/LHCL即可。0.01mol/LPH6.0柠檬酸缓冲液取柠檬酸三钠(C6H5Na3O7.2H2O)10g、柠檬酸（C6H8O7.2H2O）1.5g，加双蒸馏水至1000ml即可。10%中性福尔马林固定液40%甲醛与0.01mol/LPH7.4PBS按1：9配制。DAB（3，3-二氮联苯胺）染色液取DAB2.5mg充分溶解于5mlPBS后过滤，使用前加入3%H2O215μl即可。0.01mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)