两型豆花粉和叶表皮的扫描电镜观察

两型豆花粉和叶表皮的扫描电镜观察

2型大豆（mhicpaeaw.）属于科豆科，属于蝴蝶科。这是属于亚洲、北美和非洲东南部的两个属。两型豆种子可入药,医治妇科病;茎叶可作饲料;地上、地下都结种子,在发育植物学上有研究价值;两型豆所含异黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等作用。目前仅见到两型豆地上、地下种子实生苗发育特性和不同生境两型豆果皮和种皮扫描电镜的比较观察的报道,本研究首次对两型豆花粉和叶表皮进行扫描电镜观察,旨在为两型豆的形态分类学研究、遗传育种以及应用研究提供花粉和叶的形态学依据。1花粉大小测定从河北省青龙县祖山、秦皇岛市燕塞湖自然保护区阴坡采集自然生长的两型豆地上、地下种子(分别称为两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群),分单株收获保存,在河北科技师范学院农学系试验站田间小区播种,行距70cm,株距50cm,小区面积2m×3m,经常浇水,保持田间湿润。幼苗长出第3片真叶时搭遮阳网遮光。花粉样品制备:盛花期,采集两型豆的花,取其花蕊,光镜下镜检后,将新鲜的花粉直接均匀撒在样品杯的双面胶上,在SBC-12型离子溅射仪上溅射,移入KYKY-2800型扫描电镜观察、拍照。利用该电镜的软件(精度0.01μm)测量花粉大小,以20粒为准,取其最大值、最小值(示变化幅度)和平均值。试验重复7次。叶表皮样品制备:采用两种方法相互补充。(1)间接法:在花期,取植株中部健康、成熟的叶片,用蒸馏水冲洗干净,分叶基、叶尖、叶缘、叶中部部分,在2.5%戊二醛中固定4.5h,用pH7.3的PBS缓冲液冲洗3次,10min/次,梯度酒精脱水后加入HMDS(六甲基二硅胺烷)液干燥,15min/次,更换2次,吸出多余液体,样品在空气中干燥,用双面胶将样品粘在样品杯上,溅射,在电镜下观察,拍照。各取5个材料,每个材料观察5个视野,表皮毛密度和气孔密度是25个视野气孔数的平均值;气孔大小及保卫细胞侧壁厚度亦用上述软件测量,以每个视野2个气孔共50个气孔为准,取其平均值。(2)直接法:取植株中部成熟叶片,去尘,于叶片中脉中段与叶缘之间切取2mm×2mm方块,用双面胶固定于样品杯上,直接在电镜下观察,拍照。2结果与分析2.12型豆花粉2.1.1两型豆燕塞湖居群花粉的萌发沟不明显,在扫描电镜下,两型豆花粉侧面观为近球形至矩球形,极面多为半球形,少数有凹陷,偶见发育不良的花粉。两型豆祖山居群花粉为三孔沟,多数萌发沟不明显(图版Ⅰ,1),有的为浅凹陷,萌发孔清晰,多呈圆形,平均直径为6.20μm,变化范围为5.35~7.32μm;孔膜由两个半圆形结构组成,或下陷,或突出,与花粉外表面平齐的孔膜及突出花粉外表面的孔膜多有裂隙。两型豆燕塞湖居群花粉为三孔沟,萌发沟明显(图版Ⅰ,2),沟长平均为23.74μm,变化范围为21.67~27.31μm;最宽处平均为6.36μm,变化范围为4.82~7.70μm。萌发沟在极面不汇合,将花粉分为三个明显的沟间区和沟界区,沟间距离近相等,萌发孔在萌发沟最宽处,多数不易观察到。因此,两型豆祖山居群花粉属于萌发沟不明显型,两型豆燕塞湖居群花粉属于萌发沟明显型。两个供试材料花粉粒极轴平均长度为32.93μm,两型豆燕塞湖居群极轴长度的最大值为37.42μm,两型豆祖山居群极轴长度的最小值为29.37μm。赤道轴平均长度为23.05μm,两型豆燕塞湖居群赤道轴长度的最大值为23.73μm,两型豆祖山居群赤道轴长度的最小值为15.52μm。花粉极轴与赤道轴之比(P/E)的平均值为1.44,两型豆祖山居群花粉为1.47,两型豆燕塞湖居群花粉为1.40(表1)。2.1.2两型豆燕塞湖居群花粉表土体分析在扫描电镜下,两型豆祖山居群花粉外表侧面具有疣状至块状突起,沟间区往往有凹陷,极面有粗网纹。两型豆燕塞湖居群花粉外表仅有疣状突起,沟间区较饱满,极面亦有粗网纹。因此,两型豆花粉表面纹饰具有相似性。2.2叶片的表皮特征2.2.1皮质膜的制备两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群叶的上、下表皮均有角质膜,上表皮表面蜡被呈细网状(图版Ⅰ,4),紧贴角质膜;下表皮细胞表面蜡被呈棒状,多层、蓬松(图版Ⅰ,5、6)。2.2.2牙的形态两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群叶的上、下表皮细胞形态均不规则,犬牙交错,排列紧密,垂周壁呈波浪状,外切向壁突出,细胞之间有凹陷,整个叶片表面凹凸不平,容易存留尘埃(图版Ⅰ,4~8)。叶脉表皮细胞长方形,沿叶脉方向纵向排列(图版Ⅰ,8),在脉梢处表皮细胞为单列分布。2.2.3表皮细胞及织物形态两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群叶的上、下表皮均有表皮毛分布,表皮毛均为单细胞非腺毛,基部较粗,末端渐细,大部分横截面呈圆形,个别为扁形,表面有疣状突起。非叶脉表皮毛基部有6~12个放射状排列的表皮细胞(图版Ⅰ,3、8),叶脉表皮毛基部则无此结构(图版Ⅰ,8)。从表2可看出,两型豆叶的表皮毛分布是不均匀的,就叶上表皮而言,两型豆祖山居群表皮毛密度:叶缘>叶基>叶尖>叶中,两型豆燕塞湖居群表皮毛密度:叶尖>叶缘>叶中>叶基;就叶下表皮而言,两型豆祖山居群表皮毛密度:叶基>叶缘>叶中>叶尖,两型豆燕塞湖居群表皮毛密度:叶缘>叶基=叶尖>叶中。表皮毛分布的总趋势是叶片边缘较多于中部,因为表皮毛的主要作用是反射强光,减少蒸腾,所以这种趋势可能是为了防止叶片边缘效应,降低蒸腾;下表皮毛平均密度大于上表皮毛平均密度;两型豆祖山居群上、下表皮的表皮毛平均密度大于两型豆燕塞湖居群。2.2.4两型豆祖居群气孔特征两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群叶表皮的气孔器仅分布于下表皮,上表皮无气孔器。气孔器均呈梭形,下陷,属平列型,偶见不规则型。保卫细胞外切向壁稀见蜡被,副卫细胞的外侧垂周壁呈波浪状(图版Ⅰ,6、7)。有些气孔附近有颗粒状物质(图版Ⅰ,6、10),电镜下呈白色。保卫细胞内侧壁厚度(两型豆祖山居群平均值为0.92μm,两型豆燕塞湖居群平均值为0.89μm)比外侧壁厚度(两型豆祖山居群平均值为0.77μm,两型豆燕塞湖居群平均值为0.85μm)大,这与一般气孔特征一致。从表3可看出,两型豆祖山居群气孔器(17.86μm×8.23μm)略小于两型豆燕塞湖居群气孔器(19.26μm×9.36μm)。两型豆祖山居群下表皮气孔密度:叶尖>叶基>叶缘>叶中,两型豆燕塞湖居群下表皮气孔密度:叶缘>叶基>叶中>叶尖。可见,两型豆下表皮气孔器分布也不均匀,总的趋势是,叶边缘气孔密度大于叶中部;两型豆祖山居群下表皮气孔密度平均值高于两型豆燕塞湖居群下表皮气孔密度平均值。2.3两型豆与不光照两型豆的形态关系观察发现,遮光两型豆叶片中部上、下表皮特征与不遮光两型豆基本相似,但是表皮毛密度和气孔密度均比不遮光两型豆低(表4),两型豆燕塞湖居群叶表皮毛基本上分布在叶脉上,这是与弱光环境相适应的结果。3形态变异的形态表现(1)由于花粉在植物个体发育中出现最晚,生活力保持时间短,且受环境因素影响较小,故其性状十分稳定,广泛应用于分类上。根据实验结果,两个供试材料花粉的形状大小、表面纹饰相似,说明了它们在演化上的近缘性和遗传上的保守性。两型豆祖山居群花粉萌发沟不明显,而两型豆燕塞湖居群花粉萌发沟明显,这种差异是两型豆在长期进化过程中适应不同生境所形成的,是稳定的,它为不同生境两型豆的形态分类提供了依据。(2)根据Walker的研究,就花粉表面纹饰的演化趋势:表面光滑→表面网状、条纹状表面→疣状、刺状而言,两型豆花粉表面有网状、疣状纹饰,说明两型豆进化程度较高,形成较晚。从气孔器来看,普遍认为气孔器不具副卫细胞,开闭能力差或不能开闭的原始;而具副卫细胞,保卫细胞壁厚度差别大,特化程度高的进化。两型豆叶气孔器开闭能力强,具有副卫细胞,保卫细胞内、外侧壁厚度差别明显,亦说明两型豆进化程度较高。(3)两型豆祖山居群和两型豆燕塞湖居群叶表皮毛和气孔密度的差异以及遮光与不遮光条件下两型豆叶表皮毛和气孔密度的差异,都充分说明两型豆叶的形态、结构对于环境的适应。(4)两型豆叶表面角质膜薄,是阴生植物叶的特征。但上、下表皮蜡被的差异、有表皮毛、气孔下陷的特征有待于进一步研究。另外,气孔附近的颗粒状物质亦可能是气孔分泌物。(5)两型豆气孔器仅分布于下表皮,而且分布不均匀,总的趋势是叶边缘多于叶中部;两型豆表皮毛分布的总趋势是叶片边缘多于中部,下表皮毛平均密度大于上表皮毛平均密度,这些可能都是遗传因素所致。(6)所采集花粉的发育阶段不同和处理溅射时间的长短都会影响观察结果。花粉采集过早,花粉粒表面仍有许多粘液,粘液往往使花粉粒结块,不易分离,如果就这样制样、观察,扫描电镜下花粉粒也就集结成堆,影响观察结果;采集的花粉也可能发育不成熟,导致观察到的有关结果失真。花粉采集过晚,花粉活力就下降,制样后观察时,图象发灰,不易得到清晰的照片。所以,经过反复