发酵工程制药-发酵工程制药菌种的选育

微生物菌种的保藏技术内容导入菌种保藏主要是根据微生物生理生化特点，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧3个条件，使菌种暂时处于休眠状态。任务内容菌种保藏目的及原理常用菌种的保藏方法一、菌种保藏目的及原理目的使菌种不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间干燥无氧缺营养低温保藏注意1、用保种培养基2、及时保藏（菌丝占斜面2/3）3、最好换胶塞4、用时活化5、严防棉塞受潮基本原则1、挑选典型菌种的优良纯种。2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）。4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株。二、常用菌种的保藏方法以母种形式保藏1.斜面低温法

斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月）特点简便

保藏时间短

易污染及退化

不适于草菇等菌类2.矿油保藏法斜面或半固体培养基穿刺培养物上加灭菌石蜡（约1cm高），保存时间1-2年。用途：用于霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等的保存矿油处理注入种管无菌检验？灭菌：152kpa、30min

去水：40~50℃烘至无色透明

淹没斜面约1cm3.自然基质保藏法基质的处理麦粒浸透、煮熟

麸皮拌湿装管灭菌接种培养干燥器去水特点防衰老、保藏时间长

转接后生长旺

易污染，灭菌要彻底4、沙土保藏法特点：干燥、无营养用途：保存比较干燥的微生物孢子或芽孢、放线菌。保存时间数年或数十年5、冷冻真空干燥法原理：在极低温度下快速的将菌体细胞冻结且保持完整，在减压条件下利用升华现象出去水分，真空条件下熔封管口称为冻干法。特点：干燥、低温、无氧、保护剂，保存时间可达15年以上。保护剂：牛乳血清、糖类、甘油、二甲基亚砜6、液氮冷冻保藏技术原理：将安瓿管置于-70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。使用时从液氮罐中取出，立即放置在38～40℃水浴中使其溶化，而后直接将其接种到适宜的培养基中即可。特点：此法存活率高，稳定性强，保藏时间长，是长期保藏菌种的最好方法。冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上简便简便简便简便有效简便有效1、菌种保藏的目的原理。思考与讨论：我学到什么？任务菌种保藏的基本方法有哪些？各方法适宜保藏的菌种有何不同？为什么？2、常用菌种保藏方法:菌种的退化与复壮内容导入在微生物研究应用领域，菌种的退化是一种潜在威胁，性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。任务内容一、菌种的退化：定义、现象原因及防治衰退的措施二、菌种的复壮：定义、复壮的方法一、菌种的衰退菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。1.衰退（degeneration）衰退的原因：①基因突变，②分离现象。菌种衰退的现象及原因变异有正变（自发突变）和负变两种。菌种退化的主要原因是基因的负突变。常见的菌种退化现象中，最易觉察到的是菌落形态、细胞形态和生理等多方面的改变随着菌种保藏时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。衰退：菌种出现或表现出负变性状菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种自发突变不纯菌种传代增殖衰退菌种原始个体突变个体菌种衰退的现象1.菌落和细胞形态改变2.生长速度缓慢，产孢子越来越少；3.生产性能下降：代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降4.对生长环境的适应能力减弱菌种衰退的原因1.有关基因的负突变2.育种后未经很好的分离纯化3.培养条件的改变4.污染杂菌防止衰退的措施1）减少传代次数；4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；2）创造良好的培养条件；5）采用有效的菌种保藏方法；二、菌种的复壮（rejuvenation）使衰退的菌种恢复原来优良性状狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。菌种的复壮措施①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。②通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillusthuringiensis的复壮）；③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。④采用有效的菌种保藏方法。1、菌种的退化：定义、现象原因及防治衰退的措施思考与讨论：我学到什么？任务1、怎样防止菌种的衰退？2、怎样判断菌种的衰退？2、菌种的复壮：定义、复壮的方法菌种的自然选育（一）菌种选育种子培养发酵生产产物分离纯化成品灭菌培养基的优化工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性状或增加新的性状。菌种选育改良的具体目标

•改变生物代谢途径，提高目标产物的产量•提高目标产物的纯度，减少副产物提问：生产菌从来源分为哪几类？野生型菌种、突变菌、基因工程菌经验育种定向育种诱变育种自然选育菌种选育基因工程育种杂交育种定向育种经验育种一、野生型菌株的来源非人工诱变自然选育：不经过人工诱变处理，而直接进行筛选的育种方法菌种的自发突变的两种可能：菌种衰退，生产性能下降；菌种代谢更加旺盛，生产性能提高。1.从大自然中分离筛选的菌种2.从自发突变的菌种中筛选的菌种。二、分离的原则原则：依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地筛选出目的菌种。如，在筛选分泌某种特定成分的微生物时，根据所需物质的特性和微生物的性质制定筛选方案实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。三、新菌分离的步骤1.案例筛选能降解石油的菌株时，方法是在受石油污染的土壤或水域中取样，配置以石油为唯一碳源的合成培养基，筛选出仍能快速生长的菌株，获得性能优异的单菌落。2.请根据上述案例归纳菌种筛选的步骤平板分离确定采集样品的生态环境（有针对性的采集样品）确定特定的增殖条件确定特殊的选择培养基及可能的定性或半定量检出法调查研究及查阅充分的资料设计实验方案采样增殖培养人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。较优化3-5株原种斜面筛选初筛复筛再复筛确定发酵培养基基本条件（1株1瓶）（1株3～5瓶）←定性或半定量测定单株纯种培养菌种鉴定保藏及生产性能试验毒性试验等自然选育的含义菌株分离的原则菌株分离的步骤小结菌种的自然选育（二）菌种的筛选流程初筛文献调研设计实验方案较优化3-5株单株纯种培养复筛采样增殖培养平皿分离菌种鉴定一、采样1、采样对象以采集土壤为主，也可以是植物、腐败物品和某些水域等。

一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。2、采土方式选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，应便及时分离。二、增殖培养指利用不同微生物间生命活动特点的不同，人为地提供一些特定的环境条件，使特定微生物旺盛生长，使其在数量上占优势，更利于分离出该特定微生物，称为增殖培养也叫富集培养。方法：1、控制一定的养分；如：为目的菌株提供唯一氮源或碳源2、控制一定的培养条件。如：控制PH●细菌和放线菌要求pH7.0～7.5●霉菌和酵母菌要求pH4.5～6三、培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态，因此还必须分离纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点。纯种分离的方法有稀释分离法、划线分离法。1.稀释平皿分离法a.倾注平皿分离法b.涂布平皿分离法2.平皿划线分离法a.分区划线分离法b.连续划线分离法2、控制培养基的酸碱度如：要分离耐高渗透压酵母菌，在采用含40%葡萄糖的培养基时，PH控制2.0~4.0，几乎分离出的酵母菌全都是耐高渗透压的。纯种分离时培养条件的控制措施：1、营养成分的控制如：若要分离产淀粉酶的微生物，可以用淀粉作唯一碳源。3、添加抑制剂如分离放线菌时，加10%的酚，可抑制细菌和霉菌4、热处理根据芽孢对热的耐性而淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物。6、通气条件的控制5、控制培养温度纯种分离时培养条件的控制措施：四、生产能力的检测筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异.1、初筛平板筛选如，水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌落周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生菌。初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将大量的菌落淘汰。用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株，羧甲基纤维素钠作培养物2、复筛采用与生产相近的培养基和培养条件