益肾化湿微丸中防风、陈皮、清半夏的薄层鉴别 中药学专业

益肾化湿微丸中防风、陈皮、清半夏的薄层鉴别目录259921前言 1287142材料与仪器 2303122.1实验材料 2130392.2试剂和仪器 226943实验方法与结果分析 4111223.1防风薄层鉴别研究 492233.2陈皮薄层鉴别研究 14289043.3清半夏薄层鉴别研究 21195404讨论 305354.1防风 3077214.2陈皮 3044954.3清半夏 3085714.4展望 3112431参考文献 3212431综述 3412431致谢 40前言益肾化湿处方一般应用于慢性疾病肾小球肾炎，即肾功能:SCr＜2mg/dl时，临床表现为脾虚湿盛证，即患者出现蛋白尿，水肿，畏寒，四肢冰冷，疲倦乏力等。该处方由人参、黄芪、独活、防风、白术、半夏、黄连和陈皮等16味药材组成。慢性肾小球肾炎又可以简称为慢性肾炎，是指基本的临床表现为蛋白尿、血尿、高血压和水肿等，起因多样，且病变进展较为缓慢，可能存在肾功能的减退，存在肾功能恶化趋势，甚至最终可能发展成为慢性肾衰竭的一系列肾小球疾病[1]。根据中医学说的阴阳五行理论可知，肾主水，即肾的功能有藏精和调节人的水液等。众多古代典籍对此皆有记载，《素问·上古天真论》:“肾者主水，受五脏六腑之精而藏之。”，《素问·逆调论》:“肾者水脏，主津液。”，在调节体内水液平衡方面，肾有着极为重要的意义，在中医理论中，主要靠肾气的“开”和“阖”来调节体内水液的分布和排泄。防风味辛、甘，性温，归膀胱、肺、脾、肝经，祛风解表，胜湿止痛，且有止痉的作用[2]；陈皮味辛、苦，性温，归脾、胃、肺经，理气健脾，调理中焦，燥湿化痰[2]；清半夏味辛，性温，有毒性，归脾、胃经，降逆止呕，燥湿化痰，消痞散结[2]。这三种药材均有祛湿的作用，均对肾调节“水”有影响，同时查阅相关文献发现三味药材均对肾病治疗有重要意义[3,4,5]。特别是防风，早在1995年发布的关于中医治疗慢性肾小球肾炎的文章中出现[6]。因此，增加防风、陈皮和清半夏三味药材的薄层鉴别将更好控制新产品质量和疗效，对提高产品在市场中的竞争力也具有极为重要的意义。在中成药薄层鉴别方法中，防风用于鉴别的成分一般是升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷[7,8,9]，陈皮主要鉴别成分为橙皮苷[10,11,12,13]，清半夏则主要使用半夏对照药材进行对比鉴别[14]。国外药企在20世纪初就开始了对缓释、控释和缓释、控释制剂的研究，至今已有40多年的历史。众所周知，缓释控释药物制剂发展十分迅速，并有持续上升的趋势。微丸剂又称小丸剂（pellet）,直径约为1mm～2.5mm，小球状口服药物剂型，于药厂大批量制备出来的微丸在500～1500µm范围内。可制成胶囊剂、片剂或其它剂型供给临床使用[15]。目前国内中药微丸主要使用微晶纤维素作为赋形剂，结构结实，能起到很好的缓控释作用[16,17]。采用不同的处方及不同的制备方法，可以将药物制成速释、缓释或者其它用途的微丸剂型。微丸剂较于颗粒剂药物,使药物的作用时间延长了，药物浓度一直保持在一个合适的治疗窗口，提升药效同时减低副作用，增大获得重现性比较好的临床效果的几率，并且流动性好，粉尘少，利于生产时控制质量[18]。益肾化湿颗粒制成微丸剂能起到缓释作用，利于提高疗效，所以新剂型研发在当前情势下非常有必要性。且建立主斑点清晰无干扰的重现性、专属性和耐用性都较好的适用于益肾化湿微丸中防风、陈皮和清半夏的TLC鉴别的方法，为益肾化湿微丸质量标准的制定提供实验依据。2材料与仪器2.1实验材料益肾化湿微丸中试样品（批号20171001、20171002、20171003）防风对照药材（中检所12094-201108、中检院120947-201409）陈皮对照药材（中检院120969-201510）半夏对照药材（中检院121272-201605）升麻素苷对照品（中检所111522-200406）5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中检所111523-200405）橙皮苷对照品（中检所110721-200613）缬氨酸对照品（中检所140681-200401）亮氨酸对照品（中检所140687-200401）精氨酸对照品（中检所140685-200401）丙氨酸对照品（中检所140680-200401）益肾化湿处方缺少防风药材制成的阴性样品益肾化湿处方缺少陈皮药材制成的阴性样品益肾化湿处方缺少清半夏药材制成的阴性样品2.2试剂和仪器2.2.1试剂丙酮（广州化学试剂厂）95%乙醇（广州化学试剂厂）三氯甲烷（广州化学试剂厂）二氯甲烷（广州化学试剂厂）甲醇（天津市大茂化学试剂厂）乙酸乙酯（广州化学试剂厂）甲苯（广州化学试剂厂）甲酸（广州化学试剂厂）冰醋酸（广州化学试剂厂）石油醚（60～90℃）（广州化学试剂厂）水饱和正丁醇（制法：正丁醇和蒸馏水1:1混合，充分振摇，静置至分层，取上层）0.5%氢氧化钠溶液（取5g氢氧化钠，用蒸馏水溶解，定容成1000mL）10%硫酸乙醇溶液（取5.7mL硫酸加乙醇定容成100mL）1%三氯化铝溶液（取三氯化铝1g，加乙醇定容成100mL）茚三酮试液（取茚三酮2g，加乙醇定容成100mL）蒸馏水2.2.2设备电子分析天平（广州广电计量检测股份有限公司）洁盟牌超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）TC-15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）恒温水浴锅W201D（上海申顺生物科技有限公司）半自动点样仪CZ-042（力扬企业有限公司）TH-Ⅱ型薄层加热器（上海科哲生化科技有限公司）数码成像系统Digistore1JFP-21（力扬企业有限公司）硅胶G板（青岛海洋化工厂有限公司）硅胶GF254板（青岛海洋化工厂有限公司）2.2.3玻璃仪器及其他锥形瓶、圆底烧瓶、玻璃棒、分液漏斗、漏斗、流分瓶、烧杯，容量瓶、层析缸、一次性注射器、尼龙滤头和滤纸。3实验方法与结果分析采用TLC法对成品中防风（以防风对照药材、升麻素苷对照品、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品作为对照）、陈皮（以陈皮对照药材、橙皮苷对照品作为对照）、清半夏（以半夏对照药材、精氨酸对照品、丙氨酸对照品、缬氨酸对照品、亮氨酸对照品作为对照）三味药材分别进行鉴别，根据《中药质量标准分析方法验证指导原则》（《中国药典》2015版四部通则0502项）对每味药材的TLC法进行研究，包括前处理、精密度（重现性）、专属性和耐用性（不同的薄层板、点样方式、展开温度及相对湿度等）。3.1防风薄层鉴别研究3.1.1药典方法采用《中国药典》2015年版一部防风的鉴别项（2）中样品制备方法制备供试品、防风对照药材、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品、阴性溶液：取本品研碎的粉末5g，加入丙酮20mL，进行20min超声处理后，滤过，取其滤液，水浴蒸干，残渣加入乙醇0.5mL溶解，作为供试品溶液。取缺防风的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，同法制得阴性溶液。另取防风对照药材1g，同上制法，残渣用1mL乙醇溶解，制成对照药材溶液。再取等量升麻素苷对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加乙醇稀释至哥1mg/mL，制成混合对照品溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述几种溶液各10µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4:1）为展开剂展开，取出晾干，置于紫外光灯（254nm）下检视。结果见图1，阴性样品在与混合对照品对应位置上有明显有干扰斑点，故本法不是鉴别本品的最适方法。3.1.2样品制备方法优化取微丸研碎的粉末5g，加入蒸馏水30mL，振摇使大部分溶解，超声30min，用水饱和正丁醇萃取4次，正丁醇和蒸馏水按1:1用量，合并正丁醇层，水浴蒸干，其残渣用2mL丙酮充分溶解，用一次性注射器及尼龙滤头滤过，作为供试品。取缺防风的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液。取1g对照药材防风，同法制得对照药材溶液。选取用药典方法中制得混合对照品。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述几种溶液各2µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1）为展开剂展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液显色，105℃下加热，置于紫外光灯（365nm）下检视。结果见表1，图2。可见采用制法2所制备的样品，供试品、对照品及对照药材中主斑点均能达到良好分离效果，且阴性样品无干扰，本研究选择制法2作为样品制备方法。T：25℃，RH：65%原点位置溶剂前沿原点位置溶剂前沿123456图1中国药典防风TLC法鉴别益肾化湿微丸紫外光灯（254nm）检视1-3.供试品；4.阴性样品；5.防风对照药材；6.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照T：25℃，RH：65%123456123456A1A2123456123456B1B2图2益肾化湿微丸中防风TLC鉴别样品制备方法比较A1，A2：制法1；B1，B2：制法2A1，B1：UV254nm；A2，B2：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；6.阴性样品表1益肾化湿微丸中防风TLC鉴别样品制备方法比较名称方法来源方法差异结果制法1制法2《中国药典》2015年版一部防风鉴别项（2）方法优化：取微丸粉末5g，加入蒸馏水30mL，振摇使大部分溶解，超声30min，用水饱和正丁醇萃取4次，正丁醇和蒸馏水按1:1用量，合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣用2mL丙酮充分溶解，用一次性注射器及尼龙滤头滤过，作为供试品①加丙酮超声提取；②残渣用乙醇溶解。①加水超声提取；②用水饱和正丁醇萃取；③残渣用丙酮溶解；④10%硫酸乙醇溶液显色。主斑点未能良好分离。主斑点达到良好分离，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷能够有效地表达。3.1.3展开系统考察比较三个展开系统（二氯甲烷-甲醇-水分别为7:3:0、6.5:2.5:1、5.5:3.5:1）的展开效果，结果展开系统为二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1）的图谱中与对照品相应位置上的两个点分离较好，且阴性样品无干扰现象，展开效果最佳，故选择二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1）作为展开系统，结果见图3。T：25℃，RH：65%123456123456123456A1B1C1123456123456123456A2B2C3图3益肾化湿微丸中防风TLC鉴别不同展开系统比较A1，A2：二氯甲烷-甲醇-水（7:3:0）；B1，B2：二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1）C1，C2：二氯甲烷-甲醇-水（5.5:3.5:1）A1，B1，C1：UV254nm；A2，B2，C2：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；6.阴性样品3.1.4点样量考察考察点样量为1～5mL对展开效果的影响。点样量2µL时，主斑点分离效果较好，无拖尾现象发生，且用量较少，故本研究选择点样量为2µL，结果看图4。T：25℃，RH：70%123412341234123412341µL2µL3µL4µL5µLA123412341234123412341µL2µL3µL4µL5µLB图4益肾化湿微丸中防风TLC鉴别不同点样量比较A：10%硫酸乙醇溶液显色，UV254nm；B：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1.供试品；2.防风对照药材；3.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；4.阴性样品3.1.5点样方式考察考察点状和带状两种点样方式对展开效果的影响，结果两种点样方式均能良好分离，且主斑点清晰无干扰，故两种点样方法均适用，结果见图5。T：25℃，RH：70%1234123412341234带状点状带状点状AB图5益肾化湿微丸中防风TLC鉴别不同点样方式对比A：UV254nm；B：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1.供试品；2.防风对照药材；3.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；4.阴性样品3.1.6预饱和考察考察预饱和及未预饱和对展开效果的影响，结果两种操作均能良好分离，但未饱和状态下易出现边缘效应，影响图谱美观，甚至可能影响样品分析结果，建议展开前进行预饱和处理，结果见图6。3.1.7温度考察考察温度为10、25、30、40℃对展开效果的影响，结果10℃时Rf值小于药典规定的最小值0.2，其他温度下分离效果均不错，故展开温度对本法鉴别益肾化湿微丸中防风有影响，建议展开温度为20-40℃，结果见图7。3.1.8相对湿度考察考察相对湿度为35%、60%、70%、80%、95%对展开效果的影响，在不同湿度下分离效果均不错，主斑点清晰，且Rf值均在药典规定范围内，故湿度对对本法鉴别益肾化湿微丸中防风无影响。结果见图8。T：25℃，RH：70%123456123456A1A2123456123456B1B2图6益肾化湿微丸中防风TLC鉴别预饱和考察A1，A2：未预饱和；B1，B2：预饱和15minA1，B1：UV254nm；A2，B2：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；6.阴性样品T：10℃，RH：70%T：25℃，RH：70%T：30℃，RH：70%T：40℃，RH：70%123456123456123456123456A1B1C1D1123456123456123456123456A2B2C2D2图7益肾化湿微丸中防风TLC鉴别不同温度对展开效果的影响A1，A2：10℃；B1，B2：25℃；C1，C2：30℃；D1，D2：40℃A1，B1,C1，D1：UV254nm；A2，B2，C2，D2：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；6.阴性样品T：25℃，RH：35%T：25℃，RH：60%T：25℃，RH：70%T：25℃，RH：80%T：25℃，RH：95%123456123456123456123456123456A1B1C1D1E1123456123456123456123456123456A2B2C2D2E2图8益肾化湿微丸中防风TLC鉴别不同相对湿度比较A1，A2：35%；B1，B2：60%；C1，C2：70%；D1，D2：80%；E1，E2：95%A1，B1,C1，D1，E1：UV254nm；A2，B2，C2，D2，E2：10%硫酸乙醇溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.防风对照药材；5.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；6.阴性样品3.1.9防风薄层鉴别条件制备方法：取微丸粉末5g，加入蒸馏水30mL，振摇使大部分溶解，超声30min，用水饱和正丁醇萃取4次，正丁醇和蒸馏水按1:1用量，合并正丁醇层，蒸干，残渣用2mL丙酮充分溶解，用一次性注射器及尼龙滤头滤过，作为供试品。取缺防风的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液。取1g对照药材防风，同法制得对照药材溶液。取药典方法制得的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品。点样量：2mL。点样方式：不控制。预饱和：建议预饱和。温湿度：建议20-40℃，相对湿度不控制。展开系统：二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1）下层溶液。显色剂：10%硫酸乙醇溶液。检视方法：在105℃下加热2min，紫外光灯（365nm）下检视。标准：在供试品的色谱中，与对照药材、对照品色谱相应的位置上，分别有相同颜色的斑点显现，且阴性样品无干扰现象。3.1.10中试样品鉴别采用以上防风薄层鉴别方法对三批中试样品（批号：20171001、20171002、20171003）进行验证。结果显示，三批样品分离度均不错，主斑点清晰，阴性无明显干扰，故本法适用于鉴别益肾化湿微丸中的防风。结果见图9。T：26℃，RH：80%123456789101112图9益肾化湿微丸中防风TLC鉴别三批样品检验结果10%硫酸乙醇溶液显色后，紫外光灯（365nm）检视1-3.20171001；4-6.20171002；7-9.20171003；10.防风对照药材；11.升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷混合对照品；12.阴性样品3.2陈皮薄层鉴别研究3.2.1药典方法采用《中国药典》2015年版一部陈皮的鉴别项（2）中样品制备方法制备供试品、陈皮对照药材、橙皮苷对照品、阴性溶液：取本品粉末3g，加10mL无水甲醇，加热回流20min，滤过，取5mL滤液浓缩为1mL，作为供试品溶液；取缺陈皮的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得到阴性溶液；取0.5g对照药材陈皮，同法制得陈皮对照药材溶液；取适量橙皮苷对照品，加入甲醇溶解，制成饱和溶液作为橙皮苷对照品。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述几种溶液各5µL，分别点于同一0.5%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100:17:13）为展开剂，展开2cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20:10:1:1）为展开剂，展开9cm，取出晾干，喷1%三氯化铝溶液显色，紫外光灯（365nm）下检视。结果见图10，橙皮苷分离度差，Rf值过小，不符合药典规定范围，且阴性有干扰，故该方法不适用于本品。T：25℃，RH：73%原点位置溶剂前沿原点位置溶剂前沿123456图10中国药典陈皮TLC法鉴别益肾化湿微丸三氯化铝溶液显色后紫外光灯（365nm）检视1-3.供试品4.陈皮对照药材5.橙皮苷对照品6.阴性样品3.2.2样品制备方法优化根据成分特点，优化陈皮样品的制备方法，取本品微丸粉末5g，加入30mL乙醇，浸渍过夜，滤过，取其滤液作为供试品溶液；取缺陈皮的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液；取0.5g对照药材陈皮，同法制得对照药材溶液；取药典法所用橙皮苷对照品作为本优化法的对照品。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述几种溶液各8µL，分别点于同一块0.5%氢氧化钠制备过的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-氨水-水（4:1:0.03:0.03）为展开剂展开，取出，晾干，1%三氯化铝溶液显色，置于紫外光灯（365nm）下检视。可见采用制法2所制备的样品，供试品、对照品及对照药材中主斑点均能达到良好分离效果，Rf值符合药典规定范围，主斑点清晰，阴性样品无干扰现象，且操作简单，故本研究选择制法2作为样品制备方法。结果见表2，图11。表2益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别样品制备方法比较名称方法来源方法差异结果制法1制法2《中国药典》2015年版一部陈皮鉴别项（2）方法优化：取本品微丸粉末5g，加入30mL乙醇，浸渍过夜，滤过，取滤液作为供试品溶液。①加无水甲醇10ml，加热回流20分钟；②浓缩。①浸渍；②不浓缩。主斑点未能达到良好分离。主斑点达到良好分离，橙皮苷能有效表达。T：25℃，RH：70%123456123456AB图11益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别样品制备方法比较A:制法1；B：制法2A,B：1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.陈皮对照药材；5.橙皮苷对照品；6.阴性样品3.2.3展开系统考察比较三个展开系统（三氯甲烷-甲醇-氨水-水分别为2:1:0:0、2:1:0.03:0.03、4:1:0.03:0.03）的展开效果，结果展开系统为三氯甲烷-甲醇-氨水-水（2:1:0.03:0.03）的图谱中与对照品相应的点分离较好，且阴性样品无干扰现象，展开效果最佳，最美观，故选择三氯甲烷-甲醇-氨水-水（2:1:0.03:0.03）作为展开系统，结果见图12。T：25℃，RH：70%123456123456123456ABC图12益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同展开系统比较A：三氯甲烷-甲醇-氨水-水（2:1:0:0）；B：三氯甲烷-甲醇-氨水-水（2:1:0.03:0.03）C：三氯甲烷-甲醇-氨水-水（4:1:0.03:0.03）A，B，C：1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.陈皮对照药材；5.橙皮苷对照品；6.阴性样品3.2.4点样量考察考察点样量为7、8、9、10、11µL对展开效果的影响。点样量7～9mL时，主斑点清晰且分离效果较好，Rf值在规定范围内，故本研究选择点样量为8µL，结果看图13。T：25℃，RH：70%123412341234123412347mL8mL9mL10mL11mL图13益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同点样量比较1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1.供试品；2.陈皮对照药材；3.橙皮苷对照品；4.阴性样品3.2.5点样方式考察考察点状和带状点样方式对展开效果的影响，结果分离效果均不错，故益肾化湿微丸中陈皮的薄层鉴别两种点样方式均适用，结果见图14。T：25℃，RH：70%12341234带状点状图14益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同点样方式对比1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1.供试品；2.陈皮对照药材；3.橙皮苷对照品；4.阴性样品3.2.6预饱和考察考察预饱和及未预饱和对展开效果的影响，结果未饱和状态下易出现边缘效应，且Rf值有明显差异，故展开前必须进行必须预饱和，预饱和时间建议大于等于15min，结果见图15。T：25℃，RH：70%123456123456AB图15益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别预饱和考察A，B：1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.陈皮对照药材；5.橙皮苷对照品；6.阴性样品3.2.7温度考察考察温度为10、25、30、40℃对展开效果的影响，结果10℃时Rf值小于药典规定的最小值0.2，其他温度下均能达到良好的分离效果，故展开温度对本法鉴别益肾化湿微丸中陈皮有明显影响，建议展开温度为20-40℃，结果见图16。3.2.8相对湿度考察考察相对湿度为35%、50%、60%、70%、85%对展开效果的影响，在不同湿度下均能较好分离，Rf值均在药典规定范围内，故展开湿度对本法鉴别无影响，见图17。T：10℃，RH：70%T：25℃，RH：70%123456123456ABT：30℃，RH：70%T：40℃，RH：70%123456123456CD图16益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同温度对展开效果的影响A：10℃；B：25℃；C：30℃；D：40℃A，B，C，D：1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.陈皮对照药材；5.橙皮苷对照品；6.阴性样品T：25℃，RH：35%T：25℃，RH：50%T：25℃，RH：60%123456123456123456ABCT：25℃，RH：75%T：25℃，RH：85%123456123456DE图17益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同相对湿度比较A：35%；B：50%；C：60%；D：75%；E：85%A，B，C，D，E：1%三氯化铝溶液显色，UV365nm1-3.供试品；4.陈皮对照药材；5.橙皮苷对照品；6.阴性样品3.2.9陈皮薄层鉴别条件制备方法：取本品微丸粉末5g，加入30mL的乙醇，浸渍过夜，滤过，取其滤液作为供试品溶液；取缺陈皮的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液；取陈皮对照药材0.5g，同法制得对照药材溶液；取适量橙皮苷对照品，加入甲醇溶解制成饱和溶液，作为对照品。点样量：8µL。点样方式：不控制。预饱和：需要预饱和。温湿度：建议20-40℃，相对湿度不控制。展开系统：三氯甲烷-甲醇-氨水-水（2:1:0.03:0.03）。显色剂：喷1%三氯化铝溶液显色。检视方法：置于紫外光灯（365nm）下检视。标准：在供试品的色谱中，与对照药材、对照品色谱相应的位置上，分别有相同颜色的斑点显现，且阴性样品无干扰现象。3.2.10中试样品鉴别采用以上陈皮薄层鉴别方法对三批中试样品（批号：20171001、20171002、20171003）进行验证。结果显示，三批样品分离度均较好，且阴性无干扰，故本优化法适用于鉴别益肾化湿微丸中的陈皮。结果见图18。T：26℃，RH：80%123456789101112图18益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别三批样品检验结果1%三氯化铝溶液显色后，紫外光灯（365nm）检视1-3.20171001；4-6.20171002；7-9.20171003；10.防风对照药材；11.橙皮苷对照品；12.阴性样品3.3清半夏薄层鉴别研究3.3.1药典方法1采用《中国药典》2015年版一部半夏的鉴别项（2）中样品制备方法制备供试品、阴性溶液、混合对照品：取本品粉末1.8g，加入10mL甲醇，加热回流30min，滤过，取其滤液挥至2mL，作为供试品溶液；取缺半夏的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制备得到阴性溶液；取半夏对照药材0.7g，同法制得半夏对照药材溶液；另取精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品，加70%甲醇制成1mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品、对照药材和阴性溶液各5µL，混合对照品1µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）为展开剂，展开，取出晾干，用茚三酮试液显色，在105℃加热至斑点清晰，置于日光下检视。结果见图19，图谱上供试品中与对照品相同位置的斑点能很好地分离，且阴性无干扰。T：25℃，RH：75%原点位置溶剂前沿原点位置溶剂前沿123456图19中国药典半夏TLC法1鉴别益肾化湿微丸茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品3.3.2药典方法2采用《中国药典》2015年版一部半夏的鉴别项（3）中样品制备方法制备供试品、阴性溶液、对照药材：取本品微丸粉末1.8g，加10mL乙醇，加热回流提取1h，滤过，取滤液浓缩，浓至0.5mL，作为供试品溶液；取缺半夏的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性样品溶液；另取半夏对照药材0.7g，同法制得半夏对照药材溶液；选用鉴别项（2）中混合对照品作对照品。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述几种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯-丙酮-甲酸（30:6:4:0.5）为展开剂，展开，取出晾干，10%硫酸乙醇溶液显色，105℃加热至斑点清晰，置于日光下检视。结果见图20，主斑点不清晰且分离效果不佳，阴性有干扰，故本方法不适用于益肾化湿微丸中清半夏的TLC鉴别。T：25℃，RH：75%原点位置溶剂前沿原点位置溶剂前沿123456图20中国药典半夏TLC法2鉴别益肾化湿微丸茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品3.3.3样品制备方法优化根据本品性质，对药典方法进行调整优化：取本品粉末1.8g，加甲醇50mL，加热回流30min，滤过，滤液挥至10mL，作为供试品溶液；取缺半夏的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液；取半夏对照药材0.7g，同法制得对照药材溶液；再取上述精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸混合对照品，加70%甲醇稀释5倍，制成0.2mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述样品溶液各5mL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）为展开剂，展开，取出晾干，喷茚三酮试液显色，在105℃加热至斑点清晰，置于日光下检视。结果见表3，图21。表2益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别对照品制备方法比较名称方法来源方法差异结果制法1制法2《中国药典》2015年版一部半夏鉴别项（2）方法优化：取本品粉末1.8g，加甲醇50mL，加热回流30min，滤过，滤液挥至10mL，作为供试品溶液；取丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、亮氨酸对照品，加70%甲醇制成0.2mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。①加10mL甲醇回流，制得2mL供试品；②制成每1mL各含1mg的混合对照品，点样量为1µL。①加50mL甲醇回流，制得10mL供试品；②制成每1mL各含0.2mg的混合溶液，点样量为5µL。主斑点达到良好分离，精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸能有效表达。主斑点达到良好分离，精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸能有效表达。T:25℃，RH：80%123456123456AB图21益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别样品制备方法比较A:制法1，B:制法2茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品可见，采用制法1和制法2均能达到良好的分离效果，制法2的对照品点样量与供试品一致，便于本研究，故选用制法2作为对照品制备方法。3.3.4展开系统考察比较三个展开系统（正丁醇-冰醋酸-水分别为8:3:0,8:3:1,10:3:1）的展开效果，结果展开系统为正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）的图谱最为美观，分离度较好，且阴性样品无干扰现象，展开效果最佳，故选择正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）作为展开系统，结果见图22。T:25℃，RH：80%123456123456123456ABC图22益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别不同展开系统比较A:正丁醇-冰醋酸-水（8:3:0）B:正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）C:正丁醇-冰醋酸-水（10:3:1）茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品3.3.5点样量考察考察点样量为2、3、4、5、6µL对展开效果的影响。点样量4-6µL时，主斑点清晰，且分离效果较好，故本研究选择点样量为5µL，结果看图23。3.3.6点样方式考察考察点状和带状点样方式对展开效果的影响，结果两种点样方式下分离效果均理想，故点样方式对本法鉴别益肾化湿微丸中清半夏无影响，结果见图24。T:25℃，RH：80%123412341234123412342µL3µL4µL5µL6µL图23益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别不同点样量比较茚三酮试液显色后日光下检视1.供试品；2.半夏对照药材；3.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；4.阴性样品T:25℃，RH：80%12341234带状点状图24益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别不同点样方式对比茚三酮试液显色后日光下检视1.供试品；2.半夏对照药材；3.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；4.阴性样品3.3.7预饱和考察考察预饱和及未预饱和对展开效果的影响，结果二者分离效果无明显差异，并且均不错，故预饱和处理对本法鉴别无影响，结果见图25。T:25℃，RH：80%123456123456AB图25益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别预饱和考察A:预饱和15min，B:未饱和茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品3.3.8温度考察考察温度为10、25、30、40℃对展开效果的影响，结果各点均能较好地分离，无拖尾现象，主斑点清晰，且阴性无干扰，故展开效果不受温度影响，结果见图26。3.3.9相对湿度考察考察相对湿度为35%、50%、60%、70%、80%对展开效果的影响，在不同湿度下，各点分离效果均不错，无拖尾现象，主斑点清晰，且阴性无干扰，故展开效果不受相对湿度影响，结果见图27。T：10℃，RH：80%T：25℃，RH：80%123456123456ABT：30℃，RH：80%T：40℃，RH：80%123456123456CD图26益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别不同温度对展开效果的影响A：10℃；B：25℃；C：30℃；D：40℃茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品T：25℃，RH：35%T：25℃，RH：50%T：25℃，RH：60%123456123456123456ABCT：25℃，RH：70%T：25℃，RH：80%123456123456DE图27益肾化湿微丸中陈皮TLC鉴别不同相对湿度比较A:35%，B:50%，C:60%，D:70%，E:80%茚三酮试液显色后日光下检视1-3.供试品；4.半夏对照药材；5.精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品；6.阴性样品3.3.10清半夏薄层鉴别条件制备方法：采用《中国药典》2015年版一部半夏的鉴别项（2）中样品制备方法制备供试品、阴性溶液、混合对照品：取本品微丸粉末1.8g,加甲醇10mL，加热回流提取30min，滤过，滤液挥至0.5mL，作为供试品溶液；取缺清半夏的处方量药材，照益肾化湿微丸制备工艺制备阴性微丸，与供试品溶液同法制得阴性溶液；取半夏对照药材0.7g，同法制得对照药材溶液；另取精氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸对照品，加70%甲醇制成各含0.2mg/mL的混合溶液，作为对照品溶液。点样量：5µL。点样方式：不控制。预饱和：不控制。温湿度：温度不控制，相对湿度不控制。展开系统：正丁醇-冰醋酸-水（8:3:1）。显色剂：茚三酮试液。检视方法：置于日光下检视。标准：在供试品的色谱中，与对照药材、对照品色谱相应的位置上，分别有相同颜色的斑点显现，且阴性样品无干扰现象。3.3.11中试样品鉴别采用以上清半夏薄层鉴别方法对三批中试样品（批号：20171001、20171002、20171003）进行验证。结果显示，三批样品的分离情况均不错，且阴性无干扰，故本优化法适用于鉴别益肾化湿微丸中的清半夏。结果见图28。T：26℃，RH：80%123456789101112图28益肾化湿微丸中清半夏TLC鉴别三批样品检验结果茚三酮试液显色后日光下检视1-3.20171001；4-6.20171002；7-9.20171003；10.半夏对照药材；11.精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸混合对照品；12.阴性样品4讨论4.1防风益肾化湿微丸中的防风薄层鉴别，根据《中国药典》2015年版的TLC法鉴别阴性有明显干扰，经过多次调整展开剂均未符合要求，则确定该方法不适用。优化样品制备方法后，使用药典中三氯甲烷-甲醇（4:1）的展开系统展开，样品分离效果不理想且阴性有干扰，再通过加水调整展开剂，仍是不能得到稳定并且分离效果较好的结果。经过多次摸索，改用二氯甲烷-甲醇-水（6.5:2.5:1），得到了稳定、分离效果较好、主斑点清晰且阴性无干扰的结果。经过防风薄层鉴别的方法学考察可知，温度过低和未预饱和都会影响实验结果，使实验结果不理想，故建议实验在20-40℃环境下进行，并需要进行预饱和操作。4.2陈皮益肾化湿微丸中的陈皮薄层鉴别，根据《中国药典》2015年版的TLC法鉴别样品分离效果不好，该方法不适用。参考文献中方法提取制备样品，并多次调整展开剂，选用0.5%氢氧化钠制备的硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇-氨水-水（4:1:0.03:0.03）为展开剂展开，能得到不错的分离效果。优化方法中陈皮样品的制备方法，选用0.5%氢氧化钠制备的硅胶G薄层板，以三氯甲烷-甲醇-氨水-水（4:1:0.03:0.03）为展开剂展开，也能得到不错的分离效果。对比文献方法及优化方法中陈皮样品的制备方法，优化方法中陈皮样品制备方法的操作明显更简单，故选用优化方法中陈皮样品制备方法作为本研究样品制备方法。再对比普通硅胶G板、硅胶GF254板和0.5%氢氧化钠制备的硅胶G板，0.5%氢氧化钠制备的硅胶G板效果最好，故选用0.5%氢氧化钠制备的硅胶G板。4.3清半夏益肾化湿微丸中的清半夏薄层鉴别，根据《中国药典》2015年版的TLC法鉴别项（3）制备样品并试验，有阴性有干扰，故不适用。而《中国药典》2015年版的TLC法鉴别项（2）方法分离效果好且无干扰，故把该方法进行优化调整，得到优化法。显色后置于105-150℃下加热至斑点清晰，加热时间需控制好，得到较清晰的斑点后建议趁热拍照记录结果，因为冷却后某些斑点会变淡。方法优化使对照品点样量与供试品一致，便于本研究点样量考察，故选用稀释后的对照品。4.4展望在本次方法学考察中，由于物资限制，以上三种药材的方法学考察均未进行不同薄层板厂家的薄层板比较，希望接下来能对其进行研究，使研究结果更加完善。对益肾化湿微丸中防风、陈皮、清半夏的薄层鉴别方法仍需进一步研究，使其鉴别方法更加简单，若能一种样品制备方法，鉴别几种药材，就能节省药品质量检测时间，利于日后益肾化湿微丸上市大批量生产时的药品质量检验。参考文献姚迪,李有田,黄晶,等.中药治疗慢性肾小球炎的疗效及对α_1-mGβ_2-mG的影响[J].辽宁中医杂志,2009,36(6):947-948.国家药典委员会,中华人民共和国药典2015版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015,6:120-191.高咏莉.生药防风的化学成分与药理作用研究进展[J].山西医科大学学报,2004,35(2):216-218.欧立娟,刘启德.陈皮药理作用研究进展[J].中国药,2006,17(10):787-789.王志强,李炳超.半夏药理作用研究进展[J].山西医药杂志月刊,2009(1):65-67.王薇,丁东平,刘祖雄,等.二陈颗粒的制备与质量控制[J].中国药房,2006,17(23):1782-1784.朱留成.慢性肾小球炎中医治疗[J].江苏大学学报:医学版,1995(2):148.孙景,杨继彪,张小龙,等.止咳化痰丸中黄芩和防风的薄层鉴别[J].新疆中医药杂志,2014,32(5):67-68.黄兰芷,王曙宾.连防感冒颗粒中防风薄层鉴别方法改进[J].中南药学杂志,2007,5(2):149-150.姜艳艳,刘斌,石任兵,等.防风化学成分的分离与结构鉴定[J].药学学报,2007,42(5):505-510.[10]杨璐维,陈蕾.平胃散加减方中黄芩、连翘、陈皮的薄层鉴别[J].临床医学工程,2012,19(5):821-822.[11]王薇,丁东平,刘祖雄,等.二陈颗粒的制备与质量控制[J].中国药房,2006,17(23):1782-1784.[12]寇昆明,张超.藿香正气片中白芷、陈皮、茯苓的薄层色谱鉴别[J].现代中药研究与实践,2001,15(2):28.[13]李湘平,袁檖樑,李汶.薄层色谱法定性鉴别胃可舒片中的陈皮甘草、木香[J].中国医药指南,2014(10):51-53.[14]熊玥,吴皓,刘福燕.清半夏饮片质量标准研究[J].中成药杂志,2010,32(5):883-886.[15]钟玲,许小红,杨胜玉,等.中药微丸的药学研究进展[J].时珍国医国药,2008,19(2):369-372.[16]BaertL,RemonJP.Influenceofamountofgranulationliquidonthedrugreleaseratefrompelletsmadebyextrusionspheronisation[J].InternationalJournalofPharmaceutics,1993,95(1-3):135-141.[17]SchmidtC,KleinebuddeP.InfluenceoftheGranulationSteponPelletsPreparedbyExtrusion/Spheronization[J].Chemical&PharmaceuticalBulletin,2008,47(3):405-412.[18]郑林,陆振举,张亦斌,等.制备缓释微丸质量研究[J].中国抗生素杂志,2012,37(4):320-324.综述防风、陈皮、清半夏的研究概况1前言防风为伞形科植物防风Saposhnikovia

divaricata

(Trucz.)Schischk的干燥根，辛、甘、温，归膀胱、肝、脾经。功能解表祛风,胜湿,止痉[1]。主要含挥发油,已鉴定出15种成分[2]；此外，还含有色原酮类，如升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、亥茅酚、香豆素类、多糖类等成分[3]。陈皮是芸香科植物橘CitrusretieulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮[1]，具理气健脾、燥湿化痰的功能，用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。陈皮的有效成分为挥发油和黄酮类，研究报道，黄酮类以橙皮苷含量最高[4,5]。清半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit十燥块茎经白矾[KAl(SO4)2·12H20]溶液浸泡后所得的炮制品，其记载始载于宋朝《圣济总录》。清半夏临床上长于化痰，以燥湿化痰为主，用于湿痰咳嗽，痰热内结，风痰吐逆，痰涎凝聚，咯吐不出。半夏含有多糖、有机酸、生物碱等多种化学成分，而生物碱是半夏的主要药理活性成分。半夏经过炮制制成清半夏，使其生物碱含量降低，毒性减弱。现在就防风、陈皮、清半夏的主要化学成分、药理作用及其薄层鉴别研究现状进行归纳和总结。2主要化学成分的研究现今研究发现，防风的主要化学成分有挥发性成分：2-甲基-3-丁烯-2-醇、戊醛、α-蒎烯、人参醇、β-姜黄烯、β-没药烯、十一碳烯、花侧柏烯、萘、β-桉叶醇、棕榈酸等；色原酮成分：升麻素、升麻素苷、亥茅酚、亥茅酚苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷等；香豆素类成分：补骨脂素、香柑内酯等；还含有多糖成分、有机酸成分等[2,3,6,7]。陈皮的主要化学成分有挥发性成分：D-柠檬烯、β-松油烯、β-月桂烯、间-伞花烯和β-蒎烯等；还有黄酮类成分、微量元素和其他[5,8,9]。清半夏的主要化学成分有生物碱类成分、刺激性成分、挥发油类成分、有机酸类成分、氨基酸类成分、蛋白质类成分、无机元素类成分及其他[10,17]。3药理作用的研究研究表明[6,7]，防风具有解热作用，防风95％乙醇提取物大鼠腹腔注射给药，能显著降低伤寒、副伤寒甲乙三联菌凿致热大鼠体温，防风水煎液对酵母、蛋白冻及伤寒、副伤寒甲菌苗精制破伤风类毒素混合制剂致热大鼠有解热作用；具有镇痛作用，在醋酸扭体法、热板法、鼠尾温浴法镇痛试验中，防风提取物对于热刺激、化学刺激引起疼痛的小鼠均有镇痛作用，采用热板法测定痛阈值，防风提取物能明显提高小鼠的痛阈值；具有镇静作用，防风水煎液具有协同戊巴比妥钠的催眠作用，同时可以减少小鼠自主活动次数；具有抗炎作用，在巴豆油涂耳致炎实验中，防风水煎液能明显抑制小鼠耳廓肿胀，对醋酸引起的炎症也有明显的抑制作用；还具有抗肿瘤作用，增强非特异性免疫功能的作用，抗过敏作用，抗菌、抗病毒作用，抗凝血作用，止血作用，抗惊厥作用等。相关文献表明[8,9]，陈皮对心血管系统、消化系统有影响，具有杀虫及抑制微生物活性的作用，抗衰老及抗氧化的作用。对心血管具有升压作用，对兔离体主动脉平滑肌有收缩作用，有抗血小板聚集作用。对消化酶有影响，陈皮水提液对离体唾液淀粉酶活性有明显的促进作用。对胃肠平滑肌有影响，李伟等用陈皮水煎剂灌胃后,结果发现陈皮可促进小鼠胃排空,对胃复安所致的胃排空加强作用及阿托品所致胃排空抑制作用无明显影响；陈皮对阿托品所致的肠推进有拮抗作用，但对去甲肾上腺素和异丙肾上腺素所致的肠推进无明显作用。陈皮还具有抗胃溃疡、利胆、祛痰、平喘、抗炎等作用。陈皮的化学成分复杂,药理作用广泛。由于产地不同陈皮挥发油中除含有共性成分外,还含有不同的特征成分,或许这些差异就是产地不同,功效异同之所在。且这些差异可能对挥发油的质量产生一定的影响,并对品种的鉴定有一定的区分作用。清半夏的药理作用与半夏相似，故从半夏的药理作用的研究[8,9]可知，清半夏具有抗肿瘤作用，近年来国内外对半夏的研究已表明半夏具有确切的抗肿瘤作用；具有祛痰镇咳作用，张科卫等以氨水致咳模型、酚红祛痰、家鸽呕吐实验检测半夏的总游离有机酸的作用，结果证实半夏中舍有的总游离有机酸具有止咳祛痰的作用；具有镇吐作用，半夏能激活迷走神经传出活动而具有镇吐作用，王蕾等[13]使用一定量的半夏总生物碱对水貂呕吐模型进行实验，结果显示半夏总生物碱对顺铂(7.5mg·kg-1,ip)模型和阿朴吗啡(l.6mg·kg-1,sc)模型水貂的呕吐有抑制效果，硫酸铜(40mg·kg-1,ig)模型和运动呕吐模型(100r·min-1,1h)的水貂无效，研究者认为半夏总生物碱有止呕的作用，止呕的机制与中枢抑制有关；还对肠胃具有影响，有抗早孕的作用。半夏能抑制中枢神