松毛虫可溶性蛋白和同工酶的测定与分析

松毛虫可溶性蛋白和同工酶的测定与分析

关于昆虫抗药性生理生化机制的研究，科学家主要集中在翻译酶、他人丙烯酸酯酶（ache）、多功能氧化酶（mfo）、谷胱甘醇s-转移酶（gst）的研究上，主要研究其活性的变化，而对可溶性蛋白质和同工酶电泳图谱的研究则很少。笔者将同工酶作为一种遗传标记,利用其简便、迅速、不受环境和选择压力干扰的优点,测定辽宁省3个地区松毛虫(Dendrolimussp.)的可溶性蛋白和5种同工酶(酯酶,过氧化物酶,过氧化氢酶,多酚氧化酶和超氧化物歧化酶),以此为基础对松毛虫的群体抗药性的动态发展做出初步的评估,并就不同地区松毛虫体内的同工酶系药剂处理与非处理的谱系变化进行研究,以求在昆虫抗药性生理生化研究方面有新的进展,为松毛虫的抗性治理提供依据。1材料和方法1.1油松毛虫加药剂所用松毛虫采自辽宁省阜新市阜新县卧凤沟乡、海城市二道河子林场、朝阳市朝阳县七道岭乡地区,为越冬松毛虫5龄幼虫。阜新种群为落叶松毛虫(Dendrolimussuperans(Butler)),海城、朝阳种群为油松毛虫(D.tabulaeformisTsaietLiu)。分别取30头用于药剂处理,30头放入冰箱中-80℃速冻后,转入-20℃保存。药剂处理方法(点滴法):质量分数为90%的灭多威(万灵,Methomyl)可溶性粉剂(杜邦公司生产)500倍液,每次每头用25μL,点在活的幼虫的头部,一天两次,连续10d,不断剔除死亡的个体,保留活体(说明其对药剂具有了一定的抵抗能力)。供试松毛虫样品编号见表1。1.2酶电泳的制备1.2.1脉冲离心法取1g虫体放于预冷研钵中,加0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.0)2mL及少许石英砂,在冰浴条件下,充分研磨成匀浆后,将匀浆转入离心管中,于4℃条件下在高速离心机上12000r/min离心30min,上清液即为电泳样品,放入冰箱中-20℃保存,备用。1.2.2trs-gly法非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)参照文献的方法进行,电泳仪型号为DYY-3型。分离胶的质量浓度为75g/L,浓缩胶的质量浓度为30g/L。电极缓冲液为Tris-Gly,pH=8.3。电泳在冰箱中4℃条件下进行,每样品孔进样量为20μL。浓缩胶内电流强度为15mA/板,进入分离胶后,电流调到30mA/板。1.2.3不同酶的染色可溶性蛋白质(Solubleprotein)、酯酶(EST)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、分别参照文献～文献的方法染色。1.3标准蛋白的测定方法:考马斯亮蓝G-250法,以牛血清蛋白为标准蛋白。计算结果:样品蛋白质含量(μg/g鲜质量)=查得的蛋白质含量(μg)×提取液总体积(mL)/测定取用体积(mL)×样品质量(g)2结果与分析2.1测定蛋白质含量的测定从图1可以看出,不同地区、不同种类的松毛虫标样经药剂处理后,体内的蛋白质含量均有所降低。2.2药剂处理对可溶性蛋白酶的影响可溶性蛋白、酯酶等同工酶染色后,脱色固定并立即记录、拍照,计算迁移率(Rf)值,Rf=X2/X1,(X1为起点至指示剂前沿线的距离;X2为起点至带的距离,即带的迁移距离)。有谱带的记为“1”,无谱带的记为“0”。结果见图2～图7。可溶性蛋白(Solubleprotein):可溶性蛋白的电泳图谱(图2)共有18条谱带。比较药剂处理与未处理的可溶性蛋白图谱发现:药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)在Rf4=0.197、Rf5=0.234、Rf6=0.310、Rf10=0.511、Rf11=0.553、Rf16=0.800、Rf17=0.841处增加7条谱带,在Rf7=0.353处减少一条谱带;药剂处理的油松毛虫(海城,5号)比对照(2号)在Rf4、Rf5、Rf6、Rf7处有4条谱带缺失,在Rf11=0.553、Rf14=0.741处有两条谱带增加;药剂处理的油松毛虫(朝阳,6号)比对照(3号)在Rf4、Rf5、Rf6、Rf7、Rf10、Rf11、Rf14、Rf15等于0.788处缺失了8条谱带,而在Rf16=0.800处增加了1条谱带。由此可以发现,药剂处理对可溶性蛋白酶的影响是相当大的。酯酶(EST):酯酶同工酶电泳图谱(图3)共计谱带13条。比较药剂处理的酯酶图谱,可发现所有图谱都发生了变化,说明药剂对该酶也发生了作用。药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)在Rf6=0.440、Rf11=0.671、Rf13=0.845处出现了谱带增加现象;药剂处理的油松毛虫(海城,5号)比对照(2号)在Rf1=0.095、Rf6=0.440、Rf8=0.571、Rf12=0.726、Rf13=0.845处增加了5条谱带;药剂处理的油松毛虫(朝阳,6号)比对照(3号)在Rf12=0.726、Rf13=0.845处有两条谱带增加,在Rf11=0.671处有一条谱带减少。从图3还可以看出:药剂处理后的酶带颜色均比未处理的酶带颜色深,说明药剂处理后的酶带活性均比未处理的酶带活性高。过氧化物酶(POD):过氧化物酶同工酶的电泳图谱(图4)共计7条谱带。观察药剂处理的对比图谱,发现药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)在Rf2=0.321、Rf3=0.346、Rf6=0.462、Rf7=0.494处有4条谱带减少,药剂处理的油松毛虫(海城,5号、朝阳,6号)的图谱与对照(2号、3号)比较没有发现任何变化。过氧化氢酶(CAT):过氧化氢酶同工酶的电泳图谱(图5)共计6条谱带。可观察出:药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)在Rf2=0.167、Rf3=0.274、Rf4=0.298处缺失3条谱带;药剂处理的油松毛虫(海城,5号)比对照(2号)仅在Rf3=0.274处增加1条谱带;药剂处理的油松毛虫(朝阳,6号)的图谱与对照(3号)比较,发现在Rf3=0.274、Rf6=0.524处有两条谱带缺失。多酚氧化酶(PPO):多酚氧化酶的电泳图谱(图6)共有7条谱带。比较药剂处理的图谱发现:药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)仅在Rf1=0.0375处有一条谱带增加;药剂处理的油松毛虫(海城,5号)比对照(2号)仅在Rf7=0.400处有一条谱带缺失;药剂处理的油松毛虫(朝阳,6号)比对照(3号)在Rf1=0.0375处增加了一条谱带,而在Rf7=0.400处缺失了1条谱带。超氧化物歧化酶(SOD):超氧化物歧化酶的电泳图谱(图7)共有4条谱带。比较药剂处理与未处理的超氧化物歧化酶图谱发现:药剂处理的落叶松毛虫(4号)比对照(1号)在Rf3=0.430处有一条谱带减少;药剂处理的油松毛虫(海城,5号)比对照(2号)在Rf2=0.392、Rf4=0.477处有2条谱带增加;药剂处理的油松毛虫(朝阳,6号)比对照(3号)在Rf1=0.316、Rf4=0.477处有2条谱带增加,在Rf3=0.430处有1条谱带减少。3酯酶同工酶是可靠性遗传标记可溶性蛋白和酯酶等同工酶可以作为昆虫抗药性研究的重要酶系。对各地区松毛虫药剂处理后的可溶性蛋白、同工酶与未做处理的比较,发现其谱带均发生了变化,说明可溶性蛋白、酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶等对药剂处理都有所反应,即其可以作为昆虫抗药性研究的重要酶系。药剂处理后的可溶性蛋白和同工酶谱带多数增加,即药剂处理后诱导虫体产生了一些新的蛋白,可以初步认为这些蛋白是对药剂产生抗性的抗性蛋白。酯酶同工酶是一个可靠的遗传标记。药剂处理的酯酶图谱发生的变化最明显,药剂处理后的落叶松毛虫(4号)图谱与未经处理的1号样品比较,3处出现了谱带增加现象;药剂处理后的油松毛虫(海城,5号)图谱与未经处理的2号样品比较,增加了5条谱带;药剂处理后的油松毛虫(朝阳,6号)图谱与未经处理的3号样品比较,有2条谱带增加,有一条谱带减少,即酶带均发生了变化。酯酶同工酶作为一种分子标记,不受外界环境条件的影响,遗传具有稳定性,是一个可靠的遗传标记。酯酶在棉铃虫等害虫对有机磷