GB 4789.12-2016 肉毒梭菌及其毒素检验 好

1食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:ExaminationofClostridiumbotulinumandbotulinustoxin

GB4789.12-2016第六章：致病性芽孢杆菌检验及原理2016-12-23发布

2017-06-23实施第一部分：

概述1菌体形态学

专性厌氧性G+周身鞭毛网球拍样梭状芽孢大杆菌.2菌体抵抗力

繁殖型菌体：一般，45℃以上都受到抑制，100℃经10min即可杀死

芽胞型菌体：超强，煮沸后要6h，120℃经4－5min才能杀死。3肉毒梭菌分布很广－－世界各地、各处都有。

Purecultureofthesporeformingbacterium

Clostridiumbotulinum[1,250x].

34致病性

有食物中毒和感染中毒两类

潜伏期：2h-12-36h-数日食物中毒：食物中毒的一般症状：头痛、头昏、腹痛、恶心、呕吐等；后出现肉毒梭菌毒素中毒的特征性症状－－神经麻痹，先眼部、头颈部－全身骨骼肌麻痹－－似睡状，不能抬头、除视觉外，其他感觉正常。呼吸肌麻痹死亡。

感染中毒：外伤、注射吸毒等，感染菌体，在伤口适宜条件下菌体繁殖产毒－－中毒。45肉毒毒素能产生“剧毒神经麻痹肉毒梭菌外毒素”（1）毒素分型和媒介按抗原特异性分7（8）个型－－A、B、C（Cα和Cβ）、

D、E、F和G。各型肉毒毒素所致疾病及其媒介5（2）毒素毒性是目前所知的最强烈的细菌外毒素，有A-F7个型

A型毒素毒性最强(人最敏感),是目前已知的化学毒物及细菌毒素中毒性最强的一种：其毒性比氰化钾强１万倍，比响尾蛇毒素(crotactin)约强10万倍，对人的最小致死量为１０－７g（0.1－lPg）；1g此精制毒素可杀死体重20g的小鼠２×１０１０只。战争狂人已将其作为细菌战剂，必须加强戒备。我国有A型、C型、E型和D型

6（3）中毒机理

剧毒肉毒毒素肉毒素进入血液循环后，选择性地作用于运动神经与交感神经的神经末梢，抑制神经传导介质乙酰胆碱的释放，因而引起肌肉运动障碍，发生软瘫。医学上利用麻痹肉毒素美容、治肌肉痉挛性收缩病症。www.cho-obgy.co.kr

7很强：

耐蛋白酶：不被胃液或消化酶所破坏，胰蛋白酶可活化毒素耐酸：在pH3－6范围内毒性不减弱对碱敏感：在pH8.5（1％NaOH）以上可破坏毒性对热：100℃经10—20min常被破坏。保存：毒素在干燥密封和阴暗的条件下，可保存多年。类毒素：用0.3%-0.5%甲醛处理后消除毒性并保持抗原性的外毒素即变为类毒素,可用于预防相应外毒素中毒。（4）肉毒梭菌毒素抵抗力8（5）肉毒梭菌产生肉毒毒素的条件食品自然产毒条件：污染的、在厌氧条件下制造或保存的食品，发酵或腐烂变质的食品，具营养、温度25－30℃、pH6－8、厌氧、水分活度≧0.85的条件，即可产生毒素。

9（6）罐头等包装食品有效控制肉毒毒素产生的措施能够抑制A、B、E及F型肉毒梭菌的芽孢出芽和产生毒素的条件：高压120℃5min以上（高压灭菌）；pH≦4.6（酸化食品）；水分活度≦0.85（干制品）；盐分含量≥20%(腌渍食品)；巴氏杀菌＋冷藏（蟹肉及鱼糜制品）；干燥＋冷藏；上述多种方式联合。106培养

肉毒梭菌为专性厌氧菌最适生长温度：28－37℃生长良好

最适产毒素温度为25—30℃最适pH为6-8(在8℃以上，pH4以上都可形成毒素)在普通固体培养基上，形成R型菌落，常扩展成菌苔。

desk/product/images/1000000000041.jpg117肉毒梭菌的生化特性

分解葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气明胶液化＋缓慢液化凝固血清(37℃，15d)，使牛乳消化，硫化氢＋，硝酸盐还原－。＋12第二部分国标13前言本标准代替GB/T4789.12—2003《食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》。本标准与GB/T4789.12—2003相比,主要变化如下:——标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验”;——增加了PCR鉴定方法;——增加了结果与报告;——增加了附录A;——修改了设备和材料;——修改了培养基和试剂;——修改了检验程序;——规范了样品制备过程;——修改了操作步骤中增菌和分离培养部分试验方法。141范围本标准规定了食品中肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin)的检验方法。本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。

2设备和材料2.19PCR反应管。2.20无菌注射器:1.0mL。2.21小鼠:15g~20g,每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠153培养基和试剂3.1庖肉培养基：:见A.1。

－－增菌用，含牛肉碎块、葡萄糖和淀粉等的液体或半流动培养基－－A、B型肉毒梭菌生长旺盛，而且表面浑浊，产大量气体，底有粉状或颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭味。3.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤(TPGYT):见A.2

肉毒毒素培养基3.3卵黄琼脂培养基：:见A.3

鉴别培养基:含葡萄糖和卵黄:本菌含脂肪酶，分解脂肪，产生甘油，使菌落及其周围表面覆盖着特有的彩虹样(或珍珠层样)薄层163.4明胶磷酸盐缓冲液：见A.4

－－处理稀释样品用，明胶起稳定毒素作用。3.5革兰氏染色液:见A.5。G+3.610%胰蛋白酶溶液:见A.6：

肉毒毒素耐受3.10肉毒分型抗毒诊断血清：分型3.11无水乙醇和95%乙醇。3.1210mg/mL溶菌酶溶液。3.1310mg/mL蛋白酶K溶液。3.143mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。3.15TE缓冲液。3.16~3.25：PCR材料174检验程序肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1腹腔注射小鼠增菌培养G+***

肉毒梭菌检验有芽胞大杆菌毒素基因检测*

TPGYT:胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤*186、说明

1）毒素检测：检测的目的：就是以检出肉毒毒素为标准（可进一步定型）有特殊需要时再分离鉴定菌。（1）肉毒毒素检出试验（有无）：小白鼠腹腔注射法为标准方法。（2）确证试验（定性）（3）毒力测定（强弱，选做）（4）毒素定型和菌体型试验（选做）19（1）肉毒毒素检出试验：小白鼠腹腔注射法为标准方法。

0.5mL样品上清液和胰酶激活处理液/只－各注射小白鼠3只。试验结果：

0.5h内猝死：稀释重做；

6h内死亡：典型症状：竖毛、四肢瘫软，呼吸困难，呼吸早呈箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。初步确定+

24h以后发病、死亡：样品浓缩、重做。20

（2）确证试验：取致死样上清液分成三份

上清液＋等量多型抗毒素血清－混匀－37℃，30min－－0.5mL接种小鼠上清液＋等量明胶磷酸盐缓冲液－混匀－煮沸10－20min－－0.5mL接种小鼠

上清液+等量明胶磷酸盐缓冲液-混匀－－0.5mL接种小鼠--死亡

上述结果：可判定检样中存在的毒素是肉毒毒素必要时要进行毒力测定及定型试验。

存活21

（3）毒力测定（选做）

稀释判定的上清液：50倍－－注射小白鼠各两只/0.5mL/只500倍－－注射小白鼠各两只/0.5mL/只5000倍－－注射小白鼠各两只/0.5mL/只例：计算检样所注射5000倍稀释液的动物全部存活，500倍的动物全部死亡，则可判定检样上清液所含毒素的毒力为1000MLD／mL－10000MLD／mL。

MLD：最小致死量或最小致死浓度(minimumlethaldoseMLC)系指药物/毒物在最低剂量组的一群实验动物中引起个别动物死亡的剂量和浓度

观察4d--死亡存活情况判定毒力22（4）定型试验（选做）

检样上清液＋等量A抗血清检样上清液＋等量B抗血清检样上清液＋等量C抗血清检样上清液＋等量D抗血清检样上清液＋等量E抗血清检样上清液＋等量F抗血清检样上清液＋等量G抗血清检样上清液+明胶磷酸盐缓冲液混匀，37℃作用30min，各注射小鼠两只，0.5mL/只，观察4d,观察结果。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。检样上清液:用明胶磷酸盐缓冲液适当稀释检样的离心上清液23

注解①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验；②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的4项试验也可同时进行；③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型；④进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。/topic/mus-musculus242）肉毒梭菌检出(增菌产毒培养试验)

取庖肉培养基三支，煮沸10min一15min，做如下处理：

a)第一支：急速冷却，接种检样均质液1ml一2ml；目的：检测繁殖菌体；b)第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却目的：芽孢发芽

c)第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。目的：抑制其他杂菌25肉毒梭菌在庖肉培养基中生长：

培养基中含有葡萄糖和碎肉块等，A、B型肉毒梭菌生长旺盛而且产大量气体，表面浑浊，底有粉状或颗粒状沉淀，消化肉块使其变黑有臭味。以上接种物于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同前，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。263）分离培养－菌体鉴定，需要时做卵黄琼脂平板：取毒素检测阳性的前述增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样(或珍珠层样)薄层，是鉴别该菌较好的方法，但G型菌无此现象。是因为肉毒梭菌含脂肪酶，分解脂肪，产生甘油，使菌落及其周围表面覆盖着特有的彩虹样(或珍珠层样)薄层。毒素测定同前庖肉培养基庖肉培养基(3mL--10mL)各一支，分别在30及37℃下厌氧培养7d，按前述进行肉毒毒素检测。

www.ahc-net.at/0001/antibiotika_monitor/4_00/4_00_3.htm27复习题