实验1-叶绿体的分离与荧光分析

中国海洋大学实验报告姓名：常天易系年级：海洋生命学院2012级专业：生物科学科目：分子细胞生物学实验学号：12050011006一、实验目的：、通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法、观察叶绿体的间接荧光，并了解荧光显微镜的使用方法二、实验原理颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同，一次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小。密度的先后分批沉降在离心管的底部分批收集，即可获得各个亚细胞的组分。叶绿体的分离应该在等渗溶液中进行，以免渗透压影响叶绿体，对其造成损伤。在荧光显微镜下可以观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。三、实验材料新鲜菠菜。等渗溶液：0.35mol/L氯化钠溶液，试剂：0.01%吖啶橙(acridineorange)四、实验方法１、叶绿体的分离选取新鲜的菠菜叶30.0g，放入150ml的等渗溶液中，在组织捣碎机中捣碎3min选取新鲜的菠菜叶30.0g，放入150ml的等渗溶液中，在组织捣碎机中捣碎3min取6层纱布将溶液过滤于烧杯中，取滤液4ml在1000r/min下离心2min弃去沉淀取6层纱布将溶液过滤于烧杯中，取滤液4ml在1000r/min下离心2min弃去沉淀将上清液在3000/min中离心5min，弃去上清液，沉淀即是所需的叶绿体将上清液在3000/min中离心5min，弃去上清液，沉淀即是所需的叶绿体 将沉淀用等渗溶液悬浮将沉淀用等渗溶液悬浮2、菠菜叶手撕片的制备①、下表皮因海绵组织较疏松，可以直接手撕下表皮的薄膜在显微镜下观察。游离叶绿体表皮细胞气孔保卫细胞游离叶绿体表皮细胞气孔保卫细胞图4叶表皮在蓝光照射下的间接荧光图6游离叶绿体在绿光照射下的间接荧光图5游离叶绿体在蓝光照射下的间接荧光图6游离叶绿体在绿光照射下的间接荧光图5游离叶绿体在蓝光照射下的间接荧光讨论本实验证明，在1000r/min离心2min，弃去沉淀上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液的差速离心，沉淀含有叶绿体，混有部分细胞核。在蓝光照射下发出的间接荧光可见到细胞核物质发出的绿色荧光。（图5）在制备菠菜叶手撕片时，由于下表皮上方的海绵组织较为疏松，所以可以较容易地制得下表皮的手撕片；上表皮下方的栅栏组着较为致密，所以可以通过从下表皮轻轻地挂掉下表皮和叶肉的方法来制备上表皮的手撕片。在对上下表皮的对比中可以发现，上表皮的气孔比下表皮的气孔更少，上表皮的细胞间隙比下表皮的细胞间隙更狭窄；其原因可能是上防止上表皮的水分蒸发过于强烈，以保水。菠菜是双子叶植物，其保卫细胞呈肾形，明显内壁薄，外壁厚，保卫细胞中含有叶绿体，支持淀粉——糖变化学说和苹果酸生成学说。在对菠菜手撕片标本在绿光照射下发出的间接荧光进行观察，叶片的背景颜色呈现红色，叶绿体处红色最深，可以较为清晰的显示出叶绿体的位置；同时说明叶片中还有其他物质在绿光的照射下发出红色的荧光（图3）。在对菠菜手撕片标本在蓝光照射下发出的间接荧光进行观察，叶片的背景颜色呈现绿色，部分呈现红色，不能清晰的显示叶绿体的位置。这可能是由于细胞中的核物质在蓝光的照射下造成了绿色的背景（图4）。７、在绿光照射下游离叶绿体的自发荧光呈红色，观察到的叶绿体数目较多（图3），蓝光照射下叶绿体的自发荧光也呈红色，观察到的叶绿体数目较少（图5）。８、游离的叶绿体在绿光照射下的间接荧光呈现红色。９、游离的叶绿体在蓝光照射下下的间接荧光呈现红色，有部分绿色是细胞核物质在蓝光照射下发出的。显示的叶绿体数目比在蓝光照射下的自发荧光显示的数目多。１０、综上比较，游离的叶绿体由蓝光照射发出的间接荧光的颜色强度比手撕片中叶绿体由蓝光照射发出的间接荧光的颜色强度强，游离的叶绿体由绿光照射发出的间接荧光的颜色强度和手撕片中叶绿体在由绿光照射发出的间接荧光的颜色强度差距不大；叶绿体在绿光照射下的荧光颜色强度比同样标本蓝光照射下的荧光颜色强度强；叶绿体在蓝光照射下的间接荧光强度比叶绿体在蓝光照射下的自发荧光强度强；叶绿体在绿光照射下的间接荧光强度比叶绿体在绿光照射下的自发荧光强度稍强。七、作业1.在荧光显微镜下，观察叶绿体的自发荧光时，更换滤镜系统，叶绿体的颜色是否有变化？答：实验观察到，在观察叶绿体自发荧光时，在不同的光的照射下，叶绿体的自发荧光波长没有明显的变化，因为叶绿体在吸收相应波长的光达到激发态时只会发射出一定波长的光。绿光为叶绿体的最适激发波段。在蓝光的照射下，叶绿体的自发荧光的颜色强度明显低于在绿光照射下的叶绿体自发荧光的颜色强度。实验中滤镜的作用是吸收对人眼会造成危害的光线。2.游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，其颜色和强度有无差异？为什么？答：有。游离叶绿体在蓝光照射下发出的间接荧光颜色比整体细胞在蓝光照射下发出的间接荧光颜色要深，因为游离叶绿体进行光合作用积累了大量的胞内物质其中大多没有被及时利用，因此其中的糖类等物质要高于细胞内的叶