Illumina光纤微珠芯片技术

Illumina光纤微珠芯片技术内容第一部分：光纤微珠芯片技术第二部分：基因表达研究第三部分：基因分型SNP研究第四部分：最新技术3/27/2024基因芯片的基本原理基因芯片又称DNA微阵列（microarray），把大量已知序列探针集成在一个基片上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来检测信息3/27/2024*****基因芯片的制作点样法原位合成3/27/2024基因芯片制备原位合成法，原位合成法是基于组合化学的合成原理,它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。原位合成法制备DNA芯片的关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合。点样法。基因芯片点样法首先按常规方法制备cDNA（或寡核苷酸）探针库，然后通过特殊的针头和微喷头,分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它固相基底表面上不同位点,并通过物理和化学的结合使探针被固定于芯片的相应位点。3/27/2024PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.原位合成

3/27/2024PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.3/27/2024PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright©PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.3/27/2024原位合成技术可达很高的密度合成过程中大量不完全片断残留在基片上探针序列不能太长，一般为25bp3/27/2024点样法3/27/20243/27/20243/27/2024点样技术

片断长度不受限制需要预先准备大量的核苷酸点的大小，间距较难控制3/27/2024新一代芯片技术

光纤微珠芯片

ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,2000.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,2004.3/27/20241.微珠3.1um无孔无荧光硅珠每个微珠单独质控

光纤微珠芯片---技术原理

有效的反应表面积和体积比低/无背景大小均一3/27/2024Oligator®合成工厂2.寡聚核苷酸探针光纤微珠芯片---技术原理

96孔板全自动化合成LIMS控制所有过程年生产能力>20million(20-mer)严格的QC系统OD260检测产量MALDI-TOF质谱检测UV毛细管电泳实时数码色彩监控3/27/20242.寡聚核苷酸探针3’End5’End50mer探针合成探针23mer地址序列光纤微珠芯片---技术原理

73mer3’5’合成方向3/27/202423mer50mer探针3’End5’End探针与微珠连接光纤微珠芯片---技术原理

2.寡聚核苷酸探针每个微珠上连接100万左右相同的探针3/27/2024KeyTechnologyElements:BeadChemistryHowdowemakeourBeads?Athreestepprocess!

RawBeadsSilanization–producesageneralcouplingmolecule–anamineTrimethoxyaminopropylsilaneVerystablecomparedtoothertechniquesActivationPreparesthebeadtoattachtheOligoCyanuricChlorideImmobilizationofDNAComplexityDiscretereactions96Wellmicrotiterplate

NH2OHNNNNHClCl3/27/2024每种(微珠+探针)单独合成并QC不同种微珠混合在一起形成微珠池

(1624－24,000+种微珠)2.寡聚核苷酸探针光纤微珠芯片---技术原理

高杂交特异性全长序列探针定制灵活100%质量检控QC3/27/2024KeyTechnologyElements:BeadProductionSynthesisofOligosActivatedBeadPlates+OligoPlatesGilson96TipRobotOvenPooledBeadSetQC3/27/2024acidetchstrandcladdingstrandcorephoto-resistsiliconwaferplasmaetchingcleaningOpticalfiber3µmbeadsinwells3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理

3/27/2024KeyElements:RandomBeadAssemblyMixtureofDifferentBeadTypes6x2WholeGenomeBeadChipBeadPoolispipettedontheSubstrateNoInformationofBeadIdentityandlocationonArray3/27/2024将微珠池内微珠倒入蚀刻光纤，微珠无序自组装进入小孔，每根光纤上带一个微珠每种微珠大约有~30个重复3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理

消除系统随机误差高重复性微珠之间间距均一3/27/2024光纤束-微珠3.芯片的组装光纤微珠芯片---技术原理

传统芯片图3/27/2024Decoderhybridization1Decoderhybridization2*4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理

3/27/2024Gundersonetal.(2004)

DecodingrandomlyorderedDNAarrays.GenomeResearch14,870-877.4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理

3/27/2024KeyElements:DecodingStrategyExpandsExponentially指数级解码XY=totalnumberofcodesX=totalnumberofcolorsorstatesY=totalnumberofhybridizationstagesSingleIllumiCodeStrategyExample:38=6,56148=65,53624merICode3/27/2024每张芯片上每个微珠每个特性都被质控(100%QC)位置和强度控制有多少重复小部分不合格地被捡出是Illumina出厂前的生产步骤每个芯片在出厂前已通过解码和质控解码CD随芯片送至用户处4.芯片解码光纤微珠芯片---技术原理

3/27/2024KeyElements:DecodingQualityMetrics%ofBeadsLoaded:~98%%ofBeadsDecoded:~98%BeadTypeRepresentation:~30ErrorRate:0.05%PresenceofallBeadTypesDecodingIntensitiesofeachstageFocusMetricsAllparametersmonitoredin~realtime 3/27/2024KeyElements:DecodingQualityMetrics3/27/2024BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-13/27/2024BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1GoldenGateTMGenotypingandDASLTM“UniversalArray”3/27/2024BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1FocusedGEXSets

(StandardSamplers,CustomBeadPools)3/27/2024BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16Human-1WholeGenomeGeneExpression3/27/2024BeadArrayFormatsSentrixArrayMatrixSentrixBeadChipFormatsHuman-6HumanRef-8Universal-16Custom-16InfiniumInfiniumTMWholeGenomeGenotyping3/27/2024BeadStation®扫描系统

激光共聚焦扫描系统高分辨率,0.8micron双色激光at532&635nm光纤微珠芯片---技术原理

超高分辨率全自动化定位,扫描3/27/2024BeadArrayReaderConfocallaserscanningsystemSub-micron,0.8micronTwolasers532,635nmSupportsCy3&Cy5imagingAuto-focusing,centeringandtiltingwithoutphotobleachingSupportsgenotyping,geneexpressionapplicationsScansbothArrayMatrixandBeadChipmicroarrays3/27/2024SentrixBeadChip:AnalyticalFluorescentImage3/27/2024

UserSuppliedDual-block96-wellthermalcyclerw/heatedlid2p