酶反应动力学

关于酶反应动力学中间产物学说第一节单底物酶促动力学第二节双底物酶促反应动力学第三节酶反应影响因素第2页,共54页，2024年2月25日，星期天

中间产物学说

酶动力学研究始于1902年，当时，A.Brown用酵母β-呋喃果糖糖苷酶对蔗糖进行水解。他发现当蔗糖的浓度比酶的浓度高许多时，反应速度不再取决于蔗糖的浓度，即是说，反应速度相对于蔗糖来说是零级反应。因此，他提出，蔗糖水解的总反应是由两个基本反应构成，第一步是底物与酶形成一种复合物，第二步是这种中间物生成产物并释放出酶:

k1k2E+S←→ES→P+Ek-1

这里,E、S、ES和P分别代表酶、底、酶-底物复合物和产物。中间产物学说认为,

当酶催化某个反应时,酶和底物先结合形成一个中间复合物,然后中间复合物再分解,生成产物并释放出酶。一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产物的生成取决于中间物的浓度.因此,整个酶促反应的速度取决于中间物的浓度.第3页,共54页，2024年2月25日，星期天第一节单底物酶促动力学单底物酶促动力学只有初速度才是酶的反应速度，原因：（1）底物随反应时间的延长减少；（2）酶随反应时间的延长受速度、pH的影响，酶部分变性；（3）随时间延长，产物增加，产物对酶的抑制作用；（4）产物增加，逆反应速度增加。

因此，只有初速度才是酶的反应速度。第4页,共54页，2024年2月25日，星期天一、酶浓度的影响酶促反应的速度和酶浓度成正比[S]>>[E] V∝[E]第5页,共54页，2024年2月25日，星期天反应速度:用单位时间内、单位体积中底物(S)的减少量或产物(P)的增加量来表示。单位：浓度/单位时间引起酶反应速度降低的原因：底物浓度的降低；酶的部分失活；产物对酶的抑制；产物增加引起的逆反应速度的增加研究酶反应速度以酶促反应的初速度(initialspeed)为准酶反应速度曲线时间产物浓度斜率=[P]/

t=V初速度[P]t第6页,共54页，2024年2月25日，星期天二、底物浓度对反应速度的影响1、单底物酶促反应动力学（1））米氏方程（Michaelis－MentenequationVVmax[S]可以用一个方程来表示：是最基本的动力学方程。V=Vmax[S]/(Km+[S])

v=—————Vmax·[S]km+[S]第7页,共54页，2024年2月25日，星期天酶反应速度与底物浓度的关系曲线

(条件:[E];pH;t等条件固定不变)在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征;v=k[S]当底物浓度较高时[S]增加,反应速度v增加,但增加幅度较小当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。v=Vmax

原因:中间产物学说解释E+SESE+P第8页,共54页，2024年2月25日，星期天一级反应混合级反应零级反应V[S]第9页,共54页，2024年2月25日，星期天中间复合物学说：

第一步:E+SES第二步:ES→E+PV∝[ES]1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程

第10页,共54页，2024年2月25日，星期天酶促反应的米氏方程及Km推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。米氏方程:米氏常数:第11页,共54页，2024年2月25日，星期天米氏方程讨论当底物浓度较低时,有[S]Km,代入米氏方程则有v=Vmax/Km[S],即反应速度与底物浓度呈正比,符合一级反应当底物浓度很高时,有[S]Km,代入米氏方程则有v=Vmax,即反应速度与底物浓度无关,符合零级反应当[S]=Km时,v=Vmax/2第12页,共54页，2024年2月25日，星期天米氏方程的推导令：将（4）代入（3），则：[ES]生成速度：，[ES]分解速度：即：则：(1)经整理得：由于酶促反应速度由[ES]决定，即，所以(2)将（2）代入（1）得：(3)当酶反应体系处于恒态时：当[Et]=[ES]时，(4)所以

第13页,共54页，2024年2月25日，星期天2.2.3米氏常数的意义当v=Vmax/2时，Km=[S]（Km的单位为浓度单位）,即米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。*

是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的数值，可鉴别酶。*

可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。*在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[s]时的v，或任何v下的[s]。（用Km的倍数表示）

练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？第14页,共54页，2024年2月25日，星期天2.2.4米氏常数的测定基本原则：

将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）米氏方程的双倒数形式：

1Km11—=——.—+——

vVmax[S]Vmax第15页,共54页，2024年2月25日，星期天酶动力学的双倒数图线第16页,共54页，2024年2月25日，星期天Km值的物理意义：即是Km值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。(摩尔/升)。Km是酶的一个特性常数与酶的性质有关，与酶浓度无关，只是对一定底物、一定的pH、一定的温度条件而言。V＝Vmax2VmaxVmax[S]Km+[S]2得化简得：

Km=[S]V＝Km+[S]Vmax[S]

对活细胞的实验表明：酶的底物浓度通常就在这种底物的Km值附近，不是大大高于或大大低于Km?第17页,共54页，2024年2月25日，星期天2.动力学参数的意义

(1)Km值的意义

KS=K2K1Km

=K2+K3K1Km=Ks

E+S[ES]P+EK1K3K2K4第18页,共54页，2024年2月25日，星期天酶底

物Km（mmol/L）

过氧化氢酶H2O225

脲酶

尿素

23

蔗糖酶蔗糖28棉子糖350谷氨酸脱氢酶谷

氨

酸0.12α—酮戊二酸2.0乳酸脱氢酶丙

酮

酸0.017第19页,共54页，2024年2月25日，星期天KM值与米氏方程的实际用途：例：当[S]=3Km时，反应速率相当于Vmax的百分数？V＝Km+[S]Vmax[S]

当Km已知时，任何底物浓度下被酶饱和的百分数可用下式表示：fES=[s]Km+[s]第20页,共54页，2024年2月25日，星期天可帮助推断某一

代谢反应的方向和途径和限速步骤例：酶1，2，3分别催化

ABCDKm分别为10-2,10-3,10-4，A，B，C浓度均为10-4

限速步骤？123例：丙酮酸可被乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱

羧酶催化，当丙酮酸浓度较低时，走哪条途径？

Km分别为

1.7×10-5、

1.3×10-3和

1.0×10-3mol/L第21页,共54页，2024年2月25日，星期天(2)Vmax和

k3(kcat)的意义Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。

E+S[ES]P+EK1K3K2K4(3)Kcat/km的意义Km

=K2+K3K1Kcat/km=K2+K3K3K1上限为108~109mol-1·L·s-1大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。第22页,共54页，2024年2月25日，星期天3.利用作图法测定

km和

Vmax

根据实验数据作图

v~[s][s]VVmax2KmVmax第23页,共54页，2024年2月25日，星期天双倒数作图法

[S]

1v1~V＝Km+[S]Vmax[S]v1第24页,共54页，2024年2月25日，星期天(2)Eadie-Hofstee作图法[S]

vv~v=Vmax–Km·[S]

v[S]vvVmax–KmKmVmaxV＝Km+[S]Vmax[S]第25页,共54页，2024年2月25日，星期天单底物酶促反应的反应速度与底物浓度呈双曲线关系，不易直接求出Vmax和Km的值，通常采用双倒数法进行参数估计。将米氏方程改写成以下形式以对作图，绘出曲线，横轴截距即为－值，纵轴截距则是第26页,共54页，2024年2月25日，星期天双倒数作图第27页,共54页，2024年2月25日，星期天米氏常数（Michaelis-constant）的意义a

Km的物理意义当V＝1/2Vmax时的底物浓度，为Km的物理意义。即［S］＝KmKm单位：m(mol)/Lb

Km是酶的特征性常数

不同酶,Km是不一样的。底物种类，pH（opt）,T（opt）要定下来。（E）

A＋B

C＋D此酶有4个Km值第28页,共54页，2024年2月25日，星期天第29页,共54页，2024年2月25日，星期天第30页,共54页，2024年2月25日，星期天c在一定条件下，Km表示酶与底物的亲和力有些酶有很多底物，Km值最小的底物叫此酶的最适底物，也叫酶的天然底物。d已知Km，可以求出V/Vmax与底物浓度[S]的关系。

测定Km的意义：（以上4点）第31页,共54页，2024年2月25日，星期天UnderstandingKmKmisaconstantderivedfromrateconstantsKmis,undertrueMichaelis-Mentenconditions,anestimateofthedissociationconstantofEfromS,because atequilibrium,Reversiblereaction,dissociationconstantisSosmallKmmeanstightsubstratebinding;highKmmeansweaksubstratebinding.Kmequalstothesubstrateconcentrationatwhichv=1/2vmaxk1k-1第32页,共54页，2024年2月25日，星期天UnderstandingVmaxThetheoreticalmaximalvelocity

VmaxisaconstantVmaxisthetheoreticalmaximalrateofthereaction-butitisNEVERachievedinrealityToreachVmaxwouldrequirethatALLenzymemoleculesaretightlyboundwithsubstrateVmaxisassymptoticallyapproachedassubstrateisincreased第33页,共54页，2024年2月25日，星期天米氏常数的测定双倒数作图法，即Lineweaver-Burk法。

1/V对1/S作图第34页,共54页，2024年2月25日，星期天第二节双底物酶促反应动力学双底物双产物反应A+B P+Q

双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类:

双底物双产物的反应序列反应（sequentialreactions）

乒乓反应（pingpongreactions）

有序反应（orderdreactions）随机反应（randomreactions）第35页,共54页，2024年2月25日，星期天序列有序反应；序列随机反应；乒乓反应；EAEAEBQEPQEEABPQA+EAEB+EEBAEBQEPQEEPQ+EE+PEAEPEEEBEQABPQE第36页,共54页，2024年2月25日，星期天1．序列有序反应

第37页,共54页，2024年2月25日，星期天2．序列随机反应

第38页,共54页，2024年2月25日，星期天3．乒乓反应第39页,共54页，2024年2月25日，星期天第三节酶反应影响因素温度的影响酶的最适温度（optimumtemperature）

温度影响的两个方面

:1.温度升高，酶反应速度增加在达到最适温度之前提高温度，可以增加酶促反应的速度。第40页,共54页，2024年2月25日，星期天2.温度升高，酶蛋白变性而失活。在最适温度以前，第1种影响为主。在最适温度以后，第2种影响为主。大部分酶在600C以上变性，到700C－800C酶达到不可逆变性；少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在950C下活力最高，又如牛胰核糖核酸酶加热到1000C仍不失活。第41页,共54页，2024年2月25日，星期天第42页,共54页，2024年2月25日，星期天pH的影响

非特征性常数，只在一定情况下才有意义。

1、

最适pH

当酶反应速度受pH影响，当某个pH，酶表现最大活力，此pH就是pH（opt）。

pH（opt）不是酶的特征性常数，受测定环境的影响很大。

2、pH影响的原因（1）

影响酶的构象（过酸过碱引起酶构象的变化，使酶失活）（2）

影响酶与底物的解离第43页,共54页，2024年2月25日，星期天1．酶反应的最适pH（optimum）第44页,共54页，2024年2月25日，星期天第45页,共54页，2024年2月25日，星期天2.5激活剂对酶作用的影响类别金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+

阴离子：

Cl-、Br-

有机分子还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽金属螯合剂：EDTA

大分子物质:具活性的蛋白质等,例如激活酶原的物质定义:凡是能提高酶活性的物质，称为酶的激活剂(activator）第46页,共54页，2024年2月25日，星期天非竞争性抑制作用的特性反竞争性抑制作用的特性竞争性抑制作用的特性

2.6

抑制剂对酶作用的影响第47页,共54页，2024年2月25日，星期天可逆抑制的动力学比较抑制类型VmaxKm无抑制剂VmaxKm竞争性抑制作用不变变大非竞争性抑制作用变小不变反竞争性抑制作用变小变小第48页,共54页，2024年2月25日，星期天思考题1、影响酶促反应的因素有哪些？它们是如何影响的？2、试比较酶的竞争性抑制作用与非竞争性抑制作用的异同。3、什么是米氏方程，米氏常数Km的意义是什么？试求酶反应速度达到最大反应速度的99％时，所需求的底物浓度（用Km表示）4、举例说明酶的结构和功能之间的相互关系。名词解释活性中心全酶酶原米氏方程Km诱导契合变构效应辅酶和辅基第49页,共54页，2024年2月25日，星期天、计算：（1）对于一个遵循米氏动力学的酶而言，当[S]=Km时，若ν=35umol/min，

Vmax是多少umol/min？（2）当[S]=2×10-5mol/L，ν=40umol/min，这个酶的Km是多少？（3）大致绘出此酶ν-[S]关系的曲线图形。

A、没有抑制剂存在时

B、有竞争性抑制剂存在时

C、有非竞争性抑制剂存在时四、在不同底物浓度的反应体系中，分别测有无抑制剂存在时的ν数据如下：

[S]ν（无I）ν（有I）（2.2×10-5mol/L）

mol/L（×10-4）（umol/min）（umol/min）

1.028171.536232.043295.0